Диссертация (Пространственное строение и внутримолекулярная динамика модифицированных аналогов стероидных гормонов на основе данных спектроскопии ЯМР)

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиСЕЛИВАНОВ Станислав Иванович   ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ И ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКАМОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВНА ОСНОВЕ ДАННЫХ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР Специальность 02.00.03 – Органическая химия  диссертация на соискание ученой степенидоктора химических наук    Санкт-Петербург20172ОГЛАВЛЕНИЕ1. Введение …………………………………………………………………………………………42.

Глава 1.Спектроскопия ЯМР стероидных молекул …………………………..…………...121.1 .История взаимоотношений спектроскопии ЯМР и стероидов……………...…...121.2 .Использование скалярных констант в конформационном анализе стероидов....161.3 .Использование ЯЭО в конформационном анализе стероидов…………………...211.4 .Основные направления развития методологии исследования……….…………..313.

Глава 2.Конформационный анализ 8α-аналогов эстрогенов на основеданных спектроскопии ЯМР ……………………….…………………………...…542.1.6-Окса-8α-аналоги эстрогенов …………………………………………………….542.2.6-Окса-D-гомо-8α-аналоги эстрогенов …………………………………………....712.3.8α-Аналоги эстрогенов…………………………………………………………… .912.4.D-Гомо-8α-аналоги эстрогенов ……………………………………………….….1112.5.В-Нор-8α-аналоги эстрогенов ……………………………………………………1254. Глава 3.

Конформационный ЯМР-анализ других изоаналогов эстрогенов ……………..1433.1.9β-Аналоги эстрогенов …………………………………………………….……...1433.2.13α-Аналоги эстрогенов ……………………………………………………...…. .1623.3.D-Гомоаналоги эстрогенов природного ряда ………………………………......1893.4.9β,14β-Аналоги эстрогенов …………………………………………………...…1963.5.8α,14β-Аналоги эстрогенов…………………………………………….…….…...2115. Глава 4.Конформационный ЯМР-анализ модификаций эстрогеновс дополнительными двойными связями …. …………………………...….……...2344.1.Тетраены……………………………………………………………………….…...2344.1.1.

6-Оксаэстра-1,3,5(10),8(9)-тетраены………………………….…………........2344.1.2. D-Гомо-В-нор -, D-гомо- и 14β-аналоги эстра-1,3,5(10),8(9)-тетраенов.......2564.1.3. Модифицированные аналоги эстра-1,3,5(10),8(14)-тетраенов ..................... 2854.2.Пентаены………………………………………………………………...………. 3024.2.1. Эквиленины…………………………………………………………………….3024.2.1.1. 14α-Эквиленины…………………………..………………………...……..3044.2.1.2. D-Гомоаналоги 14α-эквиленинов……………………………...………...3134.2.1.3. 14β-Аналоги эквиленинов……………………………………..……….….3254.2.2. 14β-Аналоги эстра-1,3,5(10),8(9),15(16)-пентаенов ………………..…..…... 3426. Глава 5.Конформационный ЯМР-анализ изоаналогов андрогенов…………...…...…..3505.1. 19-Нораналоги андрогенов………………………………………..……………… .35035.2.19,В-Биснораналоги андрогенов…………………...……….……………...……..3627.Заключение …………………………………………………………………………………..3738.Выводы …………………….……..…………………………….………………………….....3849.Экспериментальная часть ……………………………………………………...……….....38710.Литература11.Приложения…………………………………………………………………………….......392………………………………………………………………………………..42211.1.

Дополнительные таблицы, рисунки и пояснительные тексты……………….….42311.1.1. Приложение к главе 1 (П1)………………………………… ……………..42311.1.2. Приложение к главе 2 (П2)………………………………………………......42411.1.3. Приложение к главе 3 (П3)…………………………………..…….….…..…44011.1.4. Приложение к главе 4 (П4)…………………………………..…………..…..45611.1.5.

Приложение к главе 5 (П5)……………………………………..…….…..….46711.1.6. Приложение к экспериментальной части (П6)………………..………....…47011.2. Названия исследованных стероидных гормонов (П7)……………….....…..…...4714ВВЕДЕНИЕАктуальность работы. Важнейшей задачей структурной органической химии являетсяпоиск оптимальной системы доказательств строения химических соединений. В настоящеевремя одним из ключевых элементов этой системы, безусловно, является спектроскопия ЯМР.Возможности и достоинства этого метода хорошо известны и подробно описаны как вспециальной литературе, посвященной решению целого ряда методологических проблем, таки в огромном числе публикаций прикладного характера, в которых эти достоинствараскрываются на самых разнообразных примерах решения структурных, конформационных идинамических проблем конкретных групп химических соединений. Ведущее положение всовременных исследованиях спектроскопия ЯМР занимает благодаря основному своемудостоинству – высокой разрешающей способности, а также возникновению на рубеже 80годов прошлого века и последующему бурному развитию высокоэффективных гомо- игетероядерных корреляционных методов на основе импульсной Фурье-спектроскопии ЯМР[1].

Их использование при решении задач структурной органической химии сводится кобнаружению и корректной регистрации гомо- и гетероядерных косвенных [2] и прямых [3]внутримолекулярных диполь-дипольных взаимодействий между магнитными ядрами.Существующее разнообразие корреляционных методов ЯМР [4] и огромный спектр ихвозможностей, а также специфические особенности объектов исследования, выражающиеся вхарактерных проявлениях спектральных и релаксационных характеристик, определяютнеобходимость выявления наиболее подходящих комбинаций этих методов для исследованияконкретных объектов, которые способны дать однозначное решение поставленной задачи.Следовательно, поиск оптимального набора корреляционных методов, способных сминимальными затратами и/или с максимальной точностью определить необходимые длярешения задачи спектральные и релаксационные параметры, является неотъемлемой частьюлюбого исследования в области структурной органической химии с использованиемспектроскопии ЯМР [5].

Поэтому существенной особенностью применения методовспектроскопии ЯМР является их индивидуализация, необходимость которой продиктованаспецифическим набором проблем, характерным для определенного класса органическихсоединений или даже для конкретной молекулы. Наиболее ярким и хорошо известнымпримером такого методологического разделения является появление в начале 70-х годов ипоследующее интенсивное развитие спектроскопии ЯМР биополимеров [6‒8], для которыхбыли разработаны десятки специальных методов, учитывающих, прежде всего, большоймолекулярный вес (до ~ 50 kDa) и, соответственно, чрезвычайную перегруженность исложность спектров ЯМР 1Н этих молекул.

Более того, методологическое обеспечение таких5работ проводилось на основе интенсивного развития теории ЯМР и математических процедуробработки спектральной и релаксационной информации в условиях предела спиновойдиффузии (ωоτс >> 1). Поэтому многие выводы и рекомендации по использованиюспектроскопии ЯМР больших молекул не всегда оказываются справедливыми при изучениималых органических молекул1, находящихся в условиях экстремального сужения линий (ωоτс<< 1). В результате к середине 90-х годов сложилась ситуация, в которой практически всеуспехи и достижения спектроскопии ЯМР были связаны с исследованиями в областибиоорганической химии, анаблюдавшийся прогресс в методологии использованияспектроскопии ЯМР для сравнительно небольших органических молекул, в том числеприродного происхождения, несмотря на новые возможности, связанные с появлениемкорреляционных методов, не шел ни в какое сравнение с тем, что происходило в областиисследования строения и внутримолекулярной подвижности биополимеров [9].

Причиныопережающего развития биоорганического ЯМР заключаются не только в практическойзначимостиобъектовисследования,нотакжесостоятвнекоторыхестественныхпреимуществах работы в области предела спиновой диффузии (ωоτс >> 1). Количественныйуровень использования кросс-релаксационных данных был недоступен при исследованиималых молекул, тогда как для биоорганических молекул данные по количественной оценкемежпротонныхрасстоянийвносилинаиболеезначимыйвкладврешениезадачконформационного анализа [10], включая изучение внутримолекулярной динамики, а ядерныйэффект Оверхаузера (ЯЭО) был признан наиболее важным параметром спектроскопии ЯМР вэтой области ее применения [3].Использование явления ЯЭО при изучении малых молекул только на качественном(есть/нет) или полуколичественном (сильный/средний/слабый) уровне несомненно являлосьсдерживающим фактором развития спектроскопии ЯМР как в области доказательствапространственного строения конформационно жестких органических молекул, так и в областиизучения их конформационной подвижности.

В последнем случае наиболее привлекательнойвозможностью количественного использования ЯЭО является обнаружение быстрого в шкалевремени ЯМР конформационного обмена и независимая оценка в этих условиях населенностиминорного конформера, что связано с нелинейным характером зависимости наблюдаемогоЯЭО от межпротонного расстояния.                                                            1Здесь и в дальнейшем тексте в отношении исследуемых молекул используются принятые в спектроскопииЯМР термины “большие” и “малые”, обозначающие их размеры, при которых произведение рабочей частотыспектрометра ωо и времени корреляции вращательной диффузии τс оказывается, соответственно, больше илименьше единицы.6Цель работы.Основная цель исследования состояла в разработке новой эффективной методологиииспользования спектроскопии ЯМР для установления пространственного строения ивнутримолекулярной динамики сложных насыщенных полициклических соединений и в ееапробации на примере изучения модифицированных аналогов стероидных гормонов.Ключевыми элементами этой методологии являются полный анализ спектра ЯМР 1Н, точноеопределение межпротонных расстояний на основе ЯЭО и торсионных углов θН-Н на основезначений вицинальных констант 3JH-H и их сопоставление с соответствующими даннымирентгеноструктурного анализа (РСА) и молекулярного моделирования (ММ).

 Формирование указанной методологии и ее апробация проводились на примерахизучения широкого круга модифицированных аналогов стероидных гормонов с учетом ихспецифических спектральных и релаксационных особенностей. Для достижения указаннойцели были решены все характерные для спектроскопии ЯМР 1Н стероидных молекул задачи,связанные с идентификацией сигналов в перекрывающейся алифатической области спектра иособенностями извлечения в этих условиях необходимой информации в виде величин,характеризующих косвенные (J) и прямые (ЯЭО) парные взаимодействия между магнитнымиядрами 1Н. Наряду с измерением величин вицинальных констант 3JH-Н и скоростей кроссрелаксации σН-Н в качестве дополнительных источников информации о пространственномстроенииивнутримолекулярнойдинамикеактивноиспользовалисьдругиестереоспецифические параметры спектроскопии ЯМР, такие как геминальные (2JH-Н) и дальние(4-6JH-H) скалярные константы, а в некоторых случаях были полезны данные гетероядерного(1Н-13С) эффекта Оверхаузера. Научная новизна работы.Разработана новая эффективная методология использования корреляционнойспектроскопииЯМРпространственноговодномстроенияиидвухизмеренияхобнаружениядлябыстрыхнадежноговшкалеустановлениявремениЯМРконформационных превращений стероидных гормонов в растворе ‒ модифицированныханалоговэстрогеновиандрогенов,являющихсяпотенциальнымилекарственнымипрепаратами с широким спектром биологических свойств, в основе которой лежатколичественные оценки межпротонных расстояний с точностью не хуже ±5%, учетособенностей спектральных и релаксационных характеристик объектов исследования иполный анализ наиболее информативной алифатической области спектра ЯМР 1Н.7Впервыеобнаруженаиобъясненазависимостьхарактераотклоненийэкспериментальных величин межпротонных расстояний rij(ЯЭО), полученных с помощьюкалибровочного метода и измерения скоростей кросс-релаксации σij на основе данныхспектров NOESY, от выбора эталонного расстояния в конформационно жестких аксиальносимметричныхстероидныхмолекулах.Показано,чтопричинойзаниженныхэкспериментальных значений расстояний является выбор эталонной пары протонов, радиусвектор которой расположен ортогонально к главной оси аксиально-симметричной молекулы, арасположение радиус-вектора эталонной парывдоль главной оси, наоборот, приводит кзавышению этих экспериментальных значений.Предложениапробированспособкомпенсацииотклоненийr(ЯЭО)отихдействительных значений на основе расчета поправочного коэффициента в виде отношениявремен корреляции вращательной диффузии измеряемого и эталонного расстояний ‒ τсij/τсэт,которые для случая аксиально-симметричных молекул и известного параметра анизотропииD║/D┴ могут быть определены из соотношений Восснера.Предложен и реализован экспериментальный способ определения параметраанизотропии D║/D┴ с помощью сопоставления гетероядерных (1Н-13С) эффектов Оверхаузерав метиленовой группе стероидной молекулы.Выявлено существенное (почти в 2.5 раза) превышение экспериментальногозначения параметра анизотропии D║/D┴ для аксиально-симметричных стероидных молекул посравнению с его расчетной величиной, полученной на основании значений моментов инерции.Наосноветочногоопределениямежпротонныхрасстоянийвусловияхэкстремального сужения линий (ωоτс << 1) и их сопоставления с результатами методовмолекулярного моделирования и/или данными РСА получены доказательства быстрых вшкале времени ЯМР конформационных превращений стероидных молекул в растворе.Показано, что при обеспечении высокой (в пределах ±5%) точности оценокмежпротонных расстояний с помощью ЯЭО обнаружение минорного конформера в условияхбыстрого конформационного равновесия возможно даже при его населенности около 2%, еслив нем происходит значительное сближение пары протонов по сравнению с расстоянием междуними в доминирующем конформере.Впервые в двумерных спектрах NOESY, полученных в условиях экстремальногосужения линий (ωоτс << 1), зарегистрированы и объяснены аномальные проявления эффектовскалярной релаксации 1-го рода, которые могут приводить к существенному уменьшениюинтенсивности кросс-пиков или даже к изменению его знака на противоположный.8Продемонстрированы возможности использования ускоренного режима регистрацииспектров NOESY (Fast NOESY с фиксированным периодом повторения: AQ + D1 + τm =Const.) и приведенных к диагональным интегральных интенсивностей кросс-пиков (Sij/Sii) дляточных оценок скоростей кросс-релаксации σН-Н.Показанопреимуществосопоставленияотносительныхизмененийэкспериментальных и расчетных вицинальных констант, а не их абсолютных значений, придоказательстве сравнительно небольших конформационных деформаций стероидных молекул,приводящих к изменению торсионных углов до 10 – 15 градусов.Показаны возможность и преимущества использования точного (±0.02 Гц)измерения скалярных констант в узком интервале положительных температур длядоказательствасуществованиябыстрыхконформационныхравновесийиоценкитермодинамических параметров.На основе разработанного подхода впервые проведено систематическое изучениеособенностей пространственного строения и внутримолекулярной подвижности в раствореширокого круга новых модифицированных аналогов стероидных гормонов:‒изоаналогов эстрогенов, принадлежащих D-гомоаналогам природного ряда и 8α-, D-гомо-8α-, В-нор-8α-, D-гомо-В-нор-8α-, 6-окса-8α-, 6-окса-D-гомо-8α-, D-гомо-9β-, D-гомо-Внор-9β-, 13α-, D-гомо-13α-, 8α,14β-, 6-окса-D-гомо-8α,14β-, 6-окса-9β,14β- и 6-окса-D-гомо9β,14β-аналогам эстра-1,3,5(10)-триенов,‒изоаналогов андрогенов, принадлежащих 19-нор-, 19-нор-8α,10α-, 19,В-биснор-8α,10α-,19,В-биснор-D-гомо-8α,10α-, 19,В-биснор-9β,10α- и 19,В-биснор-D-гомо-9β,10α-изорядам,‒изоаналогов тетраенов, принадлежащих 6-окса-, D-гомо-, 6-окса-D-гомо-, В-нор-D-гомо-, 6-окса-14β-аналогам эстра-1,3,5(10),8(9)-тетраенов, эстра-1,3,5(10),8(14)-тетраенам и их6-окса-, 6окса-D-гомо-9β-аналогам,‒изоаналогов эквиленинов, принадлежащих 14α-, 14α-D-гомо-, 14β- и 14β-D-гомоаналогам эстра-1,3,5,7,9-пентаенов, и‒изоаналоговпентаенов,принадлежащих14β-и6-окса-14β-аналогамэстра-1,3,5(10),8(9),15(16)-пентаенов.Для перечисленных стероидных молекул впервые проведена полная идентификациясигналов в спектрах ЯМР 1Н, основанная на внутренних (косвенных и прямых, гомо- игетероядерных) взаимодействиях, установлен целый ряд новых закономерностей дляспектральных и релаксационных характеристик каждой из изученных модификаций –характерные диапазоны химических сдвигов ядер 1Н, наборы скалярных констант {2-6JН-Н} и9скоростей кросс-релаксации {σH-H}, и получены надежные экспериментальные доказательстваих внутримолекулярной жесткости или конформационной лабильности в растворе.ВпервыеобнаруженыбыстрыевшкалевремениЯМРконформационныепревращения, связанные с изменением пространственного строения одного, двух или дажетрех колец в следующих изоаналогах стероидных гормонов:1.в 8α- и 6-окса-8α-аналогах эстрогенов с метильной группой в положении 1 или 7αнаблюдается изменение конформации кольца В;2.в 8α,14β-аналоге эстрогенов с 7α-метильной группой наблюдается одновременноеизменение конформации кольца В и инверсия кольца С;3.в 6-окса-D-гомо-8α,14β-аналогах эстрогенов с 7α-метильной группой наблюдаетсяодновременное изменение конформации кольца В и инверсия колец С и D;4.в D-гомо-аналоге 14α-1,3,5(10),8(9)-тетраена наблюдается изменение конформациикольца В;5.в 6-окса-14-1,3,5(10),8(9)-тетраене с 7α-метильной группой наблюдается изменениеконформации кольца C;6.вD-гомо-14-1,3,5(10),8(9)-тетраенес7α-метильнойгруппойнаблюдаетсятрехпозиционное равновесие, связанное с одновременным изменением конформации кольца Cи инверсией кольца D, а также с изменением пространственного строения кольца В;7.в 14- и 6-окса-14-аналогах 1,3,5(10),8(9),15(16)-пентаена с 7α-метильной группойнаблюдается изменение конформации кольца С;8.в 16,16-диметил-14-эквиленине наблюдается изменение конформации кольца С;9.в 16,16-диметил-D-гомо-14-эквиленине наблюдается одновременное изменениеконформации кольца C и инверсия кольца D;10.в 19-нор-8α,10α-аналоге андрогенов наблюдается изменение конформации кольца А.Для перечисленных конформационно лабильных стероидных гормонов проведенаоценка относительных населенностей конформеров в растворе CDCl3 и получены оценкитермодинамических характеристик этих динамических равновесий, а в некоторых случаяхопределены значения свободных энергий активации при температуре коалесценции.Практическая значимость полученных в работе сведений о конформационнойжесткости или внутримолекулярной подвижности в растворе новых модифицированныханалогов стероидных гормонов, которые являются потенциальными лекарственнымипрепаратами с избирательным действием, заключается в повышении уровня обоснованности10отбора веществ, предназначенных для биологических исследований, и уровня качествапредварительногоанализаразличныхдокинг-взаимодействийлиганд-рецепторныхкомплексов.Самостоятельную практическую ценность представляет разработанная и апробированнаяпри изучении стероидных гормонов методология использования спектроскопии ЯМР вструктурном и конформационном анализе органических соединений, поскольку она илиотдельные ее элементы могут быть эффективно использованы для исследования другихнасыщенных полициклических молекул в растворе.