Диссертация (Пространственное строение и внутримолекулярная динамика модифицированных аналогов стероидных гормонов на основе данных спектроскопии ЯМР), страница 8

Чтобы сделать выбор между этими вариантаминеобходимо провести количественную оценку вклада каждого из них. Для этого была выбранажесткая стероидная молекула (V), которая в 1997 году изучалась с помощью спектроскопииЯМР и материалы по ее спектральному описанию готовились к публикации [234]4.Так как все отнесения сигналов в спектре ЯМР 1Н стероида (V) уже были сделаны, тобыли дополнительно зарегистрированы и одинаковым образом обработаны [235‒237] 8фазочувствительных спектров NOESY при временах смешивания τm = 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.8,1.0 и 1.2 с. Среди всех обнаруженных пространственных взаимодействий были выбраны 14пар протонов, между которыми наблюдались удобные для интегрирования кросс-пики, а ихдиагональные сигналы находились в свободных от перекрывания областях протонногоспектра. В эти пары из-за известных сложностей с обработкой и интерпретацией не быливключены протоны метильных групп [238, 239], а также протоны, расстояние междукоторыми превышало 3.0 Å [240‒242] и интегральные интенсивности соответствующих кросспиков были слишком малы для точного интегрирования.Для этих 14 межпротонных расстояний была проведена предварительная оценкавозможного вклада спиновой диффузии за счет ближайшего 3-го протона по методике работы[228].

На рисунке 1-5 показано распределение вносимых спиновой диффузией вкладов в ЯЭОмежду протонами “I” и “O” в зависимости от положения 3-го ближайшего к ним спина,которое обозначено темным кружком: ●. Хорошо видно, что для всех выбранных расстоянийвклад спиновой диффузии не превышает 2%. Такой результат вполне предсказуем, посколькудля выбранных коротких расстояний (менее 3.0 Å) 3-ий спин не может оказаться междуспинами “I” и “O” в зоне больших отрицательных значений вносимых погрешностей, котораяпоказана пунктиром. Следовательно, вклад спиновой диффузии пренебрежимо мал.                                                            4Спектры ЯМР стероида (V) рассматриваются в главе 2, где он обозначен как (2а).

В главе 1, гдеиспользуется отдельная нумерация римскими цифрами, этот стероид рассматривается лишь в качествеодного из примеров при обсуждении конкретного вопроса и имеет порядковый номер “V”.35Рис. 1-5. Оценка вклада спиновой диффузии для 14-ти межпротонных расстояний в стероиде(V) по методике работы [228].

Указанные цифры соответствуют порядковому номеру парыпротонов в таблице П2-4 приложения П2 для стероида (2а).Затем для всех расстояний были построены графики зависимостей= ƒ(τm) иполучены 14 значений скоростей кросс-релаксации σij. В качестве эталонного расстояния быловыбрано значение 1.78 Å между геминальными протонами в положении 7, а все остальныерасстояния рассчитаны с использованием формулы /9/. Полученные таким образомколичественные ЯМР-данные были сопоставлены с имевшимися результатами РСА в видекорреляционной зависимости, которая представлена на рисунке 1-6А.Результат такого сопоставления полностью соответствовал тому, что было получено длястероидных молекул в работах [198, 199]: 8 из 14 точек отклонились в область заниженныхзначений ЯМР-расстояний.

Причем отклонения некоторых из них достигали 15% отизмеряемой величины. Это в абсолютных величинах для расстояния 2.6 Å составляло почти 0.4 Å (!). Совершенно очевидно, что в таком виде эти данные не могут быть опубликованы истатья по изучению структуры стероида (V) вышла в 1998 году без количественных оценокмежпротонных расстояний [234]. Лишь через некоторое время удалось разобраться впричинах первого нашего неудачного опыта по количественному использованию ЯЭО длямалых молекул и опубликовать эти данные [243, 244] с учетом поправок на анизотропиюобщего диффузионного движения стероидных молекул в растворе. Эти результатыпредставлены на рисунке 1-6,Б.Таким образом, удалось доказать, что основная причина заниженных значений ЯМРрасстояний, полученных с использованием формулы /9/ является необоснованностьпредположения о равенстве времен корреляции эталонного и измеряемого расстояний.36Рис.

1-6. Сопоставление с данными РСА результатов измерения межпротонных расстояний встероиде (V) с помощью ЯЭО [244]. А) – изотропная модели расчета (соотношение /9/) и Б) –анизотропная модель расчета (соотношение /10/).Следовательно, в случае стероидных молекул должна быть использована формула /10/,которая отличается от предыдущей дополнительным множителем: (τcij/τcэт)1/6. Умножениеэкспериментальных данных, полученных по формуле /9/, на этот множитель означаетвведение поправки на анизотропию диффузии. Следует отметить, что для определенияпоправочного коэффициента нет необходимости определять абсолютные величины временкорреляции τcij и τcэт, а их отношение может быть рассчитано с помощью формул Восснера дляаксиально-симметричныхмолекул[245,246],еслиизвестнавеличинаотношениядиффузионных коэффициентов D║/D┴.

Оценка этой величины, которую часто называютпараметром анизотропии, может быть получена на основании расчета моментов инерциивокруг двух главных осей молекулы или даже на основании известных ее размеров: D║/D┴ ≈L2/D2, где L и D, соответственно, длина и диаметр молекулы [247], а также на основаниидополнительных релаксационных измерений на ядрах 1Н или 13С [248‒258].Используя формулы Восснера нетрудно показать, что для аксиально-симметричных37молекул в случае, если радиус-вектор выбранного эталонного расстояния rэт ориентированортогонально главной оси молекулы, а радиус-вектор измеряемого расстояния rij параллеленэтой оси, то относительная ошибка определения значения rij, связанная с анизотропиейдиффузионного движения молекулы в растворе, зависит от отношения диффузионныхкоэффициентов D║/D┴ нелинейным образом и является максимальной для любых другихориентаций указанных векторов.

Стероиды можно считать аксиально-симметричнымимолекулами, для которых главная ось “c” проходит приблизительно через кислородные атомыв положениях 3 и 17. Описание диффузионного поведения таких молекул удобнее всегопроводить в полярной системе координат, в которой положение радиус-вектора rij,соединяющего два протона определяется только полярным углом βij. Тогда получаемследующуюзависимостьмаксимальногоотносительноговкладаанизотропногодиффузионного движения от параметра анизотропии A = D║/D┴:τcij(β = 0º) /τcэт (β = 90º) = (4A + 2)/(A +5)/13/Из графика зависимости /13/, представленном на рисунке 1-7, видно, что анизотропныйфактор при использовании калибровочного метода способен в пределе (A → ∞) в 4 разаизменить наблюдаемый ЯЭО и, следовательно, внести искажение в измеряемое расстояние до26% ее действительной величины [244].Рис.

1-7.График зависимости максимальнойотносительной погрешности при оценке межъядерныхрасстояний в аксиально-симметричных молекулах наоснове калибровочного метода обработки данных поизмерению ЯЭО от отношения диффузионных константD║/D┴. Пунктиром показан диапазон вносимыхпогрешностей при значениях параметра D║/D┴ = 12±2.Причем знак этого искажения зависит от выбора эталонного расстояния, основнойхарактеристикой которого является его ориентация по отношению к главным осям изучаемоймолекулы. В верхней части рисунка 1-6 показаны три проекции молекулы стероида (V) понаправлениям ее главных осей “а”, “b” и “с”.

В случае выбора эталонного расстояния,имеющего ортогональную ориентацию относительно главной оси “c”, зависимость отполярного угла измеряемого расстояния βij имеет следующий вид:сэтсАА1/14/38На рисунке 1-8 показаны графики зависимости /14/ для различных значений параметраанизотропии А, которые могут быть использованы для определения поправки на анизотропиюдиффузии значений межпротонных расстояний, полученных калибровочным методом вприближении изотропного движения.Рис. 1-8. Зависимость анизотропного вклада в погрешность определения межпротонныхрасстояний от полярного угла βij при различных параметрах анизотропии диффузии и выбореэталонного расстояния, радиус-вектор которого ортогонален главной оси аксиальносимметричной молекулы: βэт = .Полученные этим способом заниженные значения расстояний, соответствующиезначительным (более 40º) отличиям полярного угла βij от его значения π/2 для эталонногорасстояния должны быть увеличены на величину Δr, которая дана на правой оси абсцисс.Если в качестве эталонного выбрать межпротонное расстояние, радиус-вектор которогопараллелен главной оси “c”, то вклад анизотропии диффузии в оценку расстояний,находящихся к этой оси под полярным углом βij, будет иметь противоположный характер ввиде завышенных значений измеряемых ЯМР-расстояний и он может быть рассчитан поформуле /15/:эт /15/Таким образом, выбор эталонного расстояния оказывает сильное влияние наколичественную оценку ЯМР-расстояний.

Поэтому для аксиально-симметричных молекул,таких как стероиды, необходимо вводить поправку на анизотропию общего диффузионногодвижения молекул. Для этого необходимо знать величину полярного угла βij и параметранизотропии исследуемой молекулы A = D║/D┴. При этом предпочтение следует отдавать39экспериментальным данным, которые значительно превышают расчетные значения параметраА, полученные на основании моментов инерции вокруг главных осей молекулы.

Например, вработе [252] с помощью измерения времен спин решеточной релаксации протонированныхатомов углерода-13 в тестостероне получены оценки параметра анизотропии этой молекулы:D║/D┴ = 14±2, а расчетная величина этого параметра, полученная из соотношения моментовинерции вокруг главных осей, составляет всего 5.2.

Еще более значительные расхожденияэкспериментальных и расчетных значений величины D║/D┴ были обнаружены в работе [259]при изучении динамического поведения эфиров холестерина с помощью аналогичныхрелаксационных измерений T1(13C): экспериментальное значение параметра анизотропиисоставило ~60, тогда как его расчетная величина оказалась равной 10. Похожие результатыбыли получены также в работе [251] по релаксационному (T1,13C) изучению 5α-андростана инескольких его производных. Авторы этих работ сходятся во мнении, что основной причинойзавышенных экспериментальных значений параметра анизотропии по сравнению срасчетными данными является сольватационные эффекты растворителя, которые в случаестероидов способствуют изменению их динамических характеристик в растворе.

Это можнопредставитькакобразованиеслабыхмежмолекулярныхводородныхсвязеймеждустероидными молекулами, приводящее к увеличению эффективной длины таких димерныхмолекул, и как следствие увеличение эффективной скорости диффузии вокруг главной оси“c”. В работе [251] для описания такой кратковременной ассоциации молекул использовантермин “polymerization”, который на качественном уровне вполне объясняет наблюдаемоезавышение параметра анизотропии.Результатырассмотренныхвышеработпоизучениюпродольнойрелаксациипротонированных атомов углерода-13 для оценки степени анизотропности диффузионногодвижения свидетельствуют о необходимости получения аналогичных экспериментальныхданных для корректного определения межпротонных расстояний в исследуемых стероидах спомощью анизотропной модели расчета.