Автореферат (Нарушение гипоталамической регуляции репродуктивных циклов при воздействии неблагоприятных экологических факторов), страница 5

После инкубации в течение 30 мин. при комнатной температуре пробыцентрифугировали (2 000 g, 15 мин). С супернатантом проводили реакцию Грисса, для чегок пробам последовательно добавляли сначала 1% раствор сульфаниловой кислотыв 2 М соляной кислоты, а затем, через 10 мин., 0,02% водный раствор 1-нафтилэтилендиамина16гидрохлорида. Через 30 мин. развивалась розовая окраска.

Оптическую плотность окрашенныхпродуктов измеряли при 540 нм.Определение моноаминооксидазной активности в структурах мозгаспектрофотометрическим методомК 0,73-0,75 мл раствора кинурамина (0,192-0,198 мМ) в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,8)добавляли супернатант гомогената ткани до получения общего объема 0,76 мл с конечнойконцентрацией общего белка 0,016-0,375 мг/мл и тщательно перемешивали. В холостую пробувместо биологического материала вносили раствор сахарозы в фосфатном буфере,использовавшийся для приготовления гомогенатов. Инкубацию проводили при +37 0С,периодически измеряя оптическую плотность при 327 нм.Определение содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеситурбидиметрическим методомИспользование турбидиметрического метода определения содержания общего белкав биологических материалах, известного как метод Вера [Vera J.C., 1988], вызванонеобходимостью концентрирования анализируемой пробы и внесения практически всегосупернатанта, полученного при предварительной обработке гомогенатов микроструктур мозга,в хроматографическую колонку или в реакционную среду для определения ферментативнойактивности.В основу метода положено измерение при 340 нм оптической плотности, развивающейсяв результате добавления к щелочному раствору белка равного объема 30% растворатрихлоруксусной кислоты.Содержание общего белка в реакционной смеси, в которой оценивалимоноаминооксидазную активность, определяли после окончания инкубации, регистрируяоптическую плотность при 500 нм вместо 340 нм во избежание влияния присутствиякинурамина при более коротких длинах волн.

При этом широко используемый метод Лоурине позволяет исследовать содержание белка в реакционной смеси по причине взаимодействиякинурамина с реактивами, применяемыми в вышеупомянутом методе, с развитием синегоокрашивания.Статистическая обработка результатов исследованияСтатистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных пакетовстатистических программ STATISTICA 5.0 и EXCEL общепринятыми методами вариационнойстатистики.

Данные представлены в следующем виде: среднее арифметическое  средняяошибка среднего арифметического (Мm). Для определения статистической значимостиполученных результатов были использованы: параметрический t-критерий Стьюдента (t-тест),непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U-тест), критерий согласия Пирсона (2-тест).Достоверно различающимися признавали значения при р<0,05; при 0,05<р<0,10 говорилио тенденции к изменению; при p>0,1 различия считали недостоверными. Наличие суточныхритмов исследуемых показателей оценивали при помощи непараметрического Н-критерияКрускала-Уоллиса (Н-тест).17РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕСодержание гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединномвозвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса, а также уровень половых гормоновв крови на различных стадиях эстрального циклаАнализ содержания гонадолиберина в областях гипоталамуса, ответственных за синтези секрецию этого нейрогормона, не показал достоверных различий между его уровнямив утреннее и дневное время.

Однако важно отметить, что в случае СВ-Арк была заметнатенденция роста содержания нейрогормона ко времени его преовуляторной секреции. Можнопредположить, что отсутствие при этом достоверных изменений обусловлено значительнымразбросом данных в период формирования преовуляторного пика секреции гонадолиберина(9:30 ч ЦВ).Несмотря на то, что на всех этапах данного исследования стадия эстрального циклаэкспериментальных животных определялась по влагалищному мазку и после декапитациипо состоянию маточных труб, нами также проводилась оценка фона половых гормонов в крови.Полученные данные, подтверждая результаты других исследований, указываютна достоверно (p<0,01) повышенный фон эстрадиола на стадии проэструса с максимальнымпиком в 9:30 ч ЦВ (рисунок 1).1200,5#0,450,35Проэструс0,25Диэструс0,2нМ800,3нМ#1000,4*0,15Диэструс40**0,1Проэструс#60200,050**9:3011059:30511циркадианное время, чциркадианное время, ч#– различие с показателем в 5 ч циркадианноговремени на той же стадии эстрального цикладостоверно (p<0,01; U-тест); *, ** – различияс показателем на стадии проэструса в то же времядостоверно (*р<0,05; **р<0,001; U-тест)#– различия с показателем в 5 ч циркадианноговремени на той же стадии эстрального цикладостоверны (p<0,001; U-тест); * – различияс показателем на стадии проэструса в то же времядостоверны (р<0,001; U-тест)Рисунок 1 – Содержание эстрадиолав сыворотке крови самок крысна различных стадиях эстрального цикла(M±m, n=9-13)Рисунок 2 – Содержание прогестеронав сыворотке крови самок крысна различных стадиях эстрального цикла(M±m, n=7-12)Уровень же прогестерона на обеих стадиях эстрального цикла, по нашим данным,достоверно не отличался в 5 ч ЦВ и не изменялся на протяжении всего дня на стадии диэструса,но начинал достаточно резко возрастать и достигал своего максимума к 11 ч ЦВ на стадиипроэструса (рисунок 2).18Таким образом, у животных, использованных в настоящем исследовании, наблюдаласьхарактерная для стадий диэструса и проэструса картина изменений в крови уровня половыхстероидов.Суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальнойпреоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамусана различных стадиях эстрального циклаВ проведенном нами исследовании суточной динамики содержания биогенных аминовв структурах гипоталамуса, в которых происходят синтез и секреция гонадолиберина, былообнаружено, что на стадии проэструса содержание норадреналина в МПО гипоталамусав период времени с 9 ч до 11 ч ЦВ имеет место достоверное (р<0,05) снижение содержанияэтого нейромедиатора, а к 14 ч ЦВ уже отмечается тенденция к его повышению (рисунок 3).Содержание же дофамина в той же гипоталамической структуре в указанном временноминтервале изменялось без достоверно значимых различий, что носило характер тенденций:к снижению в период с 9 ч до 11 ч ЦВ и к повышению в период с 11 ч до 14 ч ЦВ.

В СВ-Аркгипоталамуса достоверной суточной динамики содержания норадреналина выявлено не было.Однако уровень дофамина в этой структуре достоверно (р<0,05) повышался в период временис 9 ч до 11 ч ЦВ и имел тенденцию к снижению в период с 11 ч до 14 ч ЦВ (рисунок 4).2576нг/мг белканг/мг белка201510*5*54321008101214циркадианное время, ч8101214циркадианное время, ч* – различие с показателем в 9 ч циркадианноговремени достоверно (p<0,05; U-тест)* – различие с показателем в 9 ч циркадианноговремени достоверно (p<0,05; U-тест)Рисунок 3 – Суточная динамикасодержания норадреналинав медиальной преоптической областигипоталамуса самок крыс на стадиипроэструса (M±m, n=7-9)Рисунок 4 – Суточная динамикасодержания дофамина в срединномвозвышении с аркуатными ядрамигипоталамуса самок крыс на стадиипроэструса (M±m, n=5-7)Выяснениеприродысуточныхизмененийсодержаниябиогенныхаминовв гипоталамических областях, участвующих в синтезе и секреции гонадолиберина, способствуетпониманию роли этих нейромедиаторов в регуляции эстральных циклов в норме,что позволяет установить причины нарушений центральной регуляции репродуктивнойфункции при различных патологических состояниях и воздействии неблагоприятных фактороввнешней среды, а также в процессе старения.19Обнаруженные нами а) резкое снижение содержание норадреналина в МПО гипоталамусаи б) достоверный подъем содержания дофамина в СВ-Арк гипоталамуса совпадают по временис завершением преовуляторного пика секреции гонадолиберина Подобное изменениесодержания норадреналина в МПО и дофамина в СВ-Арк гипоталамуса именно в этом,достаточно узком, временном интервале может формировать тот самый нейромедиаторный фон,который необходим для реализации пика секреции гонадолиберина на стадии проэструса.Было также установлено, что в исследованных областях гипоталамуса наблюдаетсяразличная суточная динамика содержания биогенных аминов в зависимости от стадииэстрального цикла.

В МПО гипоталамуса как на стадии проэструса, так и на стадии диэструса,при котором уровень половых гормонов в крови остается относительно стабильным,наблюдались сходные суточные изменения содержания норадреналина (рисунок 5). Независимоот уровня половых стероидов в крови, содержание этого нейромедиатора подверженопостоянным ежедневным изменениям с характерным снижением в узком временном интервалес 9:30 ч до 11 ч ЦВ (р<0,01). С помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтвержденазависимость содержания норадреналина в данной гипоталамической области от временногопоказателя (p<0,001).

Так, содержание нейромедиатора при объединении данных по стадиямцикла (диэструс и проэструс) составило: 10,01,3 нг/мг белка (5 ч ЦВ), 10,30,5 нг/мг белка(9:30 ч ЦВ) и 6,80,4 нг/мг белка (11 ч ЦВ) (рисунок 6). При этом максимальной величиныуровень содержания норадреналина в этой гипоталамической структуре достигал в интервалевремени с 5 ч до 9:30 ч ЦВ, что соответствует времени оптимального проявленияпреовуляторного пика секреции гонадолиберина.121412***86*4нг/мг белка1010нг/мг белка*86422059:30циркадианное время, чПроэструс11Диэструс059:3011циркадианное время, ч* – различия с показателем в 9:30 ч циркадианноговремени в той же группе достоверны(p<0,01; U-тест)*, ** – различия с показателем в 11 чциркадианного времени достоверны(*p<0,05; **p<0,001; U-тест)Рисунок 5 – Суточная динамикасодержания норадреналинав медиальной преоптической областигипоталамуса самок крыс на различныхстадиях эстрального цикла(M±m, n=6-7)Рисунок 6 – Суточная динамикасодержания норадреналинав медиальной преоптической областигипоталамуса самок крыс (объединенныеданные по стадиям диэструса и проэструса;M±m, n=13-14)Другой нейромедиатор, дофамин, не претерпевал достоверных суточных изменений в этойгипоталамической структуре.

Отмечена лишь тенденция к снижению его уровня в период с 5 ч20до 11 ч ЦВ на стадии диэструса и к повышению его содержания в 9:30 ч ЦВ на стадиипроэструса.В СВ-Арк гипоталамуса также наблюдались изменения в содержании биогенных аминов,отличные от динамики их уровня в МПО гипоталамуса. Так, в этой гипоталамической структурене было обнаружено суточных ритмов содержания норадреналина. На обеих стадияхэстрального цикла фиксировался практически постоянный уровень нейромедиаторана протяжении всего дня.