Автореферат (1144748), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Стадииэстрального цикла в этих исследованиях определяли, начиная с трехмесячного возраста, каждые3 мес. ежедневно в течение 2 недель.В 25-дневном возрасте все животные данной серии были рандомизированно разделенына две группы: первая находилась в условиях стандартного фиксированного освещения, втораясодержалась при круглосуточном постоянном освещении.В возрасте 4 мес. животных каждой из групп рандомизированно делили на три равныеподгруппы. Животные первой подгруппы получали на протяжении всей последующей жизнив течение 5 дней в неделю в ночное время суток (с 19.00 ч до 07.00 ч) вместе с питьевой водоймелатонин в дозе 10 мг/л [Pierpaoli W., Maestroni G.J., 1987]. Животным второй подгруппыежемесячно курсами по пять дней в неделю подкожно утром (в 3 ч ЦВ) вводили эпиталонв количестве 0,1 мкг на животное в 0,1 мл физиологического раствора. Животные третьейподгруппы являлись контрольными.
В этой подгруппе выделялись две части: одни контрольныеживотные получали инъекцию физиологического раствора в те же часы, когда производиласьинъекция эпиталона, другие – питьевую воду в ночное время суток.Исследование влияния старения экспериментальных животных на содержание биогенныхаминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина,включало в себя четыре возрастные группы. Первую группу составили животные в возрасте1,5 мес. Данный возраст характеризуется открытием влагалища и формированием эстральныхциклов.
Вторая группа животных состояла из половозрелых, регулярно циклирующих самокв возрасте 7-8 мес. В третьей группе животных находились самки в возрасте 13-14 мес.,при котором еще встречаются отдельные эстральные циклы, но уже наблюдается удлинениестадий диэструса и (или) эструса. Четвертую группу животных составили самки в возрасте24 мес. и старше, в котором половая цикличность полностью прекращается и животныенаходятся в состоянии персистирующего эструса или диэструса.Препарирование структур мозга, осуществляющих регуляциюэстральных цикловИз мозга декапитированных животных выделяли гипоталамические структуры (МПО,СВ-Арк, СХЯ, серый бугор). Топографическая идентификация анатомических образованийосуществлялась с использованием атласов анатомии мозга крыс [Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л.,2001; Paxinos G., Watson C., 2007].
После выделения структуры замораживали в жидком азотеи хранили при температуре –70 0С до начала анализа.После размораживания исследуемые структуры мозга гомогенизировали в 0,3 мл 0,1 Мхлорной кислоты, содержащей 0,05% калия метабисульфита, центрифугировали (10 000 g,15 мин., +4 0С), осадок отбрасывали, а от супернатанта отбирали 0,05 мл для измеренияинтенсивности хемилюминесценции. Супернатант переносили в прибор для микрофильтрациии фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергалихроматографическому анализу в тот же день.Для определения моноаминооксидазной активности ткань гомогенизировали в 0,32 Мрастворе сахарозы, приготовленном в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4), и центрифугировали(1 000 g, 10 мин., +4 0С).
Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для проведениямоноаминоксидазной реакции.14Дляопределениясодержаниягонадолиберинагипоталамическиеструктуры0гомогенизировали в 0,3 мл 0,1 М уксусной кислоты при температуре, близкой к 0 С, после чегоподвергали термической обработке (10 мин., +100 0С) и центрифугировали (13 000 g, 15 мин.,+4 0С). От супернатанта отбирали 90 мкл (в случае МПО) либо 20 мкл (в случае СВ-Арк,с последующим десятикратным разведением 0,1 М раствором уксусной кислоты, v/v).Полученные аликвоты осторожно нейтрализовали 1 М раствором натрия гидроксидаи разбавляли буфером из тест-системы для стандартизованного иммуноферментногоопределения содержания гонадолиберина в биологических образцах (в соотношении 1:5, v/v).Из полученных растворов отбирали 50 мкл, которые использовали непосредственнодля иммуноферментного определения содержания нейропептида в гипоталамическихструктурах.Определение уровня гонадолиберина в структурах мозга иммуноферментным методомИспользована тест-система фирмы Peninsula Laboratories, LLC (США) предназначеннаядлястандартизованногоопределениясодержаниягонадолиберина(люлиберина)в биологических образцах (ткань, плазма и сыворотка крови) методом иммуноферментногоанализа.Определение уровня половых стероидов в сыворотке крови радиоиммунологическимметодомВ качестве радиоактивных лигандов использовали препараты гормонов, меченные тритиемпо четырем положениям стероидного кольца (1, 2, 6, 7) с удельной активностью 3,2-3,5ТБк/моль.
Рабочие титры антисывороток подгоняли таким образом, чтобы в холостой пробесвязывалось 30-50% активности. Неспецифическое связывание в пробе без антисывороткисоставляло 2-4% от общей активности.Уровень эстрадиола в сыворотке крови определяли после предварительной экстракциидиэтиловым эфиром. Водную часть замораживали, эфир сливали в пробирку для тестированияи выпаривали. К сухому остатку добавляли фосфатный буфер (рН 7,4) и использовалив радиоиммунологической реакции.Уровень прогестерона в сыворотке крови определяли безэкстракционным методом.Для этого в радиоиммунологическом методе использовали кислый ацетатный буфер (pH 4,0),который инактивирует кортикостеронсвязывающий белок. Ввиду высокого содержанияпрогестерона в сыворотке в анализ брали 5 мкл биологического образца, добавляли 0,1 млацетатного буфера и проводили радиоиммунологическую реакцию.К испытуемой пробе добавляли равные объемы антисыворотки в рабочем титре и растворамеченого гормона с общей активностью 8 000-10 000 имп./мин.
на пробу. Содержимое пробироктщательно перемешивали и инкубировали в течение 45 мин. при +37 0С. Адсорбцию меченогогормона, не связавшегося с антисывороткой, проводили декстран-угольной смесью(0,25% активированного угля и 0,025% декстрана с молекулярной массой 110 кДа).После инкубации уголь осаждали центрифугированием (3 500 g, 10 мин.). Для подсчетарадиоактивности надосадочную жидкость сливали в виалы со сцинтилляционной жидкостью(0,4 г дифенилоксазола, 0,04 г 1,4-ди-(5-фенил-2-оксазолилбензола), 1 л толуола).15Определение содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга методомвысокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированиемХроматографическое разделение биогенных аминов и их метаболитов осуществлялина металлической колонке Reprosil 80 ODS-2 (1004 мм, 3 мкм; Dr.
Maisch GmbH, ФРГ).Детектирование проводили на аналитической ячейке модели 5100А Coulochem II (ESA, США)при потенциале +0,65 В.Подвижная фаза содержала 6 мМ цитратного буфера, 2 мМ натрияэтилендиаминтетраацетата, 1,1 мМ натрия октилсульфоната и 7% ацетонитрила (v/v), рН 5,1.Расход элюента – 0,75 мл/мин, температура колонки – +30 0С.Количественные характеристики хроматографических пиков измерялись автоматическисистемой регистрации и обработки спектрометрической информации UniChrom 4.4(ООО «Новые Аналитические Системы», Беларусь).Определение уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови иммуноферментным методомИспользована тест-система фирмы Axis Homocysteine EIA (Великобритания)предназначенная для стандартизованного определения концентрации общего L-гомоцистеинав крови методом иммуноферментного анализа.Определение уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозгаметодом люминолзависимой хемилюминесценцииСупернатант, отобранный после гомогенизирования исследуемых микроструктур мозга,разводили фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 60 мМ калия фосфата однозамещенногои 105 мМ калия хлорида.
К 100 мкл разведенного супернатанта добавляли 650 мкл фосфатногобуфера и 50 мкл 10 мМ люминола. Для инициации свечения в пробу вносили 0,2 мл раствораводорода пероксида. Свечение измеряли в течение 2 мин. при +37 0С и определяли светосуммув относительных единицах.Определение содержания малонового диальдегида в сыворотке кровиспектрофотометрическим методомК 0,2 мл сыворотки крови прибавляли 3 мл 2% раствора ортофосфорной кислоты (рН 1,3)и 1 мл 0,8% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Пробы выдерживали в течение 45 мин.при +100 0С. Затем смесь охлаждали и экстрагировали окрашенный продукт 3 мл бутанола-1.Разделения водной и органической фаз достигали центрифугированием (1 000 g, 10 мин.).Образующийся в результате реакции между малоновым диальдегидом и 2-тиобарбитуровойкислотой триметиновый комплекс имеет характерный спектр поглощения с максимумомпри 535 нм.Определение содержания нитритов в сыворотке крови спектрофотометрическим методомДля осаждения белка к образцам сыворотки крови добавляли 30% раствор цинка сульфата(20:1, v/v).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
