Диссертация (Молекулярно-генетические аспекты развития гестоза у женщин северо-западного региона Hоссии), страница 12

В большинстве исследований были использованы микрочипы,плотность которых варьировала от 158 до 1295 зондов [Hu et al., 2009; Zhu et al., 2009;Enquobahrie et al., 2011; Mayor-Lynn et al., 2011; Noack et al. 2011; Wang et al. 2012; Betoni et al.,2013; Choi et al., 2013; Xu et al., 2014]. Всего в двух работах был применен методполнотранскриптомного секвенирования [Ishibashi et al., 2012;Weedon-Fekjær et al., 2014]. Этиисследования позволили выявить целый ряд микроРНК, содержание которых повышено илипонижено в тканях плаценты при гестозе. Биоинформационный анализ и экспериментальныеисследования показали, что идентифицированные микроРНК могут быть вовлечены в такиепроцессы, как дифференцировка, пролиферация, апоптоз, ангиогенез, инвазия и миграцияклеток трофобласта, метаболизм гормонов, клеточная адгезия, иммунный ответ, нарушениерегуляции которых ассоциировано с развитием гестоза [Hu et al., 2009; Zhu et al., 2009;Enquobahrie et al., 2011; Mayor-Lynn et al., 2011; Noack et al.

2011; Wang et al. 2012; Ishibashi etal., 2012; Betoni et al., 2013; Choi et al., 2013; Xu et al., 2014; Weedon-Fekjær et al., 2014].Результаты, полученные разными исследователями, зачастую противоречивы. Известноо 120 плацентарных микроРНК, содержание которых изменяется при гестозе. Для 24 из нихрезультаты совпадают, по крайней мере, в двух независимых исследованиях. Причиныпротиворечий неизвестны. Предполагается, что они могут быть связаны с различным дизайномисследования (использованием разных критериев при формировании групп больных, методованализа содержания микроРНК, статистических подходов для обработки результатов),небольшим размером выборок и этническими факторами [Chen and Wang, 2013; Zhao et al.,2013a].Только накопление новых фактов о содержании микроРНК позволит внести ясность врешение многих спорных вопросов и будет способствовать уточнению молекулярныхмеханизмов развития гестоза, поиску новых генов-кандидатов и биомаркеров этого осложнениябеременности..43ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Материалы исследованийОбразцы венозной крови.

Собраны образцы венозной крови 256 женщин русскойнациональности, проживающих в Северо-Западном регионе РФ. Кровь забирали в пробирки,содержащие 0,5 М раствор ЭДТА (рН=8,0) ("Greiner Bio One", Австрия), тщательноперемешивали и хранили при температуре 4 °С не более одной недели до выделения ДНК.Основную группу составили образцы крови 157 женщин с гестозом средней, тяжелойстепени и преэклампсией (классификация Савельевой и соавт., 2005), которые наблюдались иродоразрешались в ФГБНУ “НИИ АГиР им. Д.О.Отта” с 2007-2014 год.

Диагноз гестозустанавливали при наличии не менее двух клинических проявлений в следующих сочетаниях:повышение АД и отеки, протеинурия, сопровождающая повышением АД, а также классическойтриады симптомов - отеки, гипертензия, протеинурия. В группу сравнения вошли образцыкрови 99 женщин с течением беременности без осложнений, которые наблюдались иродоразрешались в родильном доме №18 г. Санкт-Петербурга в 2010 году.Для выявления клинических особенностей гестоза были изучены истории родов иноворожденных всех женщин. Учитывали следующие параметры: возраст, экстрагенитальнаяпатология, осложнения настоящей беременности, родов и послеродового периода, срок испособ родоразрешения, показатели состояния здоровья новорожденных, показатели АД ипротеинурии,отеки,основныебиохимическиепоказателикрови(сахар,аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартат аминотрансфераза (АСТ), билирубин, мочевина, креатинин,общий белок, альбумин, плацентарная щелочная фосфатаза (ПЩФ), общая щелочная фосфатаза(ОЩФ), калий, натрий, кальций), показатели состояния системы свертывания крови (времярекальцификации плазмы, индекс активированного парциального тромбопластинового времени(АПТВ), протромбиновый индекс (ПТИ), фибриноген, тромбиновое время, антитромбин III,протеин С, фибрин-мономерные комплексы (РФМК), тест на волчаночный антикоагулянт),активации внутрисосудистого свертывания крови и плазмнемии (плазмин-α2-антиплазминовыйкомплекс, Д-димер), содержание маркеров дисфункции эндотелия (фактора Виллебранда,фибронектина, гомоцистеина) и показатели липидного метаболизма (триглицериды, общийхолестерин,ХС-ЛПВП,ХС-ЛПНП,ХС-ЛПОНП,коэффициентатерогенности,общаяантиокислительная активность (ОАА)).

Для сравнительного анализа использовали результатыклинико-лабораторных исследований, которые проводились в третьем триместре до началатерапии гестоза.44У пациенток с гестозом и женщин группы сравнения было проведено генотипированиепо 21 полиморфному сайту (таблица 5).Таблица 5 - Краткая характеристика исследованных генов и их полиморфных сайтовГенНазвание продуктаЛокализациягенаrsНуклеотидная замена(делеция)Частотаминорнойаллели вевропейскихпопуляциях, %F7Коагуляционный фактор VII13q34rs604610976G>A9-20F5Коагуляционный фактор V1q23rs60251691G>A0-3F2Коагуляционный фактор II11p11.2rs179996320210G>A0-4FGBβ-субъединица фибриногена4q31.3rs1800790-455 G>A18-25ITGB3Интегрин бета 3 тромбоцитов17q21.32rs59181565Т>С11-16ITGA2Интегрин альфа 2 тромбоцитов5q11.2rs1126643807C>Т25-437q21-22rs1799899–675 5G>4G50-601q32rs236856483G>A22-301q42-43rs699704T>C35-50PAI1Ингибитор тканевого активатораплазминогена 1-го типаRENРенинAGTАнгиотензиногенAGTR1Рецептор к ангиотензину 2 типа 13q21–q25rs51861166A>C23-32AGTR2Рецептор к ангиотензину 2 типа 2Xq22-q23rs110910463123A>C34-52BKR2Рецептор к брадикинину 2 типа14q32.1-q32.2rs1799722-58T>C57-71ADRB2Адренергический рецептор β-25q31-32rs104271346A>G57-65ADRB2Адренергический рецептор β-25q31-32rs104271479C>G37-46NO-синтаза 3-го типа7q35-36rs1800779-786T>C29-481p36.3rs1801133677С>Т28-478р22rs3281595С>G11-2316q12-q21rs37642612490C>A28-36NOS3MTHFRLPLCETPМетилентетрагидрофолатредуктазаЛипопротеинлипазаТранспортер эфиров холестеринаплазмыAPOA1Аполипопротеин А-I11q23.1-q23.2rs4938303501A>G22-33SCARB1Рецептор к ХС-ЛПВП12q24.31rs58881050C>T43-56NR1H2Рецептор X печени β (LXR β)19q13.33rs2695121-103T>C45-61Примечания1 rs - идентификационный номер полиморфного сайта в международной базе NCBI dbSNP[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/].2 ХС-ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности.45Образцы плацентарной ткани.

В исследовании были использованы образцы биоптатовплацент, взятых во время операции кесарева сечения у 5 пациенток с гестозом и 6 женщин, чьябеременность протекала без осложнений. Все образцы были получены в родильных отделенияхФГБНУ “НИИ АГиР им. Д.О. Отта” в 2014 году от женщин русской национальности,проживающих в Северо-Западном регионе РФ.

Кусочки ткани вырезали из центральной частиплаценты, промывали охлажденным физиологическим раствором (0,9 % NaCl, 4°C) ("Биолот",Россия), потом помещали в пробирки с консервирующим раствором "RNAlater" ("Ambion",Великобритания). Пробирки выдерживали сутки при 4°С и потом хранили при -70°С довыделения РНК.При анализе историй родов и новорожденных обращали внимание на возраст,экстрагенитальную патологию, осложнения настоящей беременности, родов и послеродовогопериода, срок родоразрешения, показатели состояния здоровья новорожденных, отеки,показатели АД и протеинурии.2.2 Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материалаВыделение ДНК из венозной крови.

ДНК выделяли в соответствии с описанным влитературе фенольным методом [Sambrook et al., 1989] с некоторыми модификациями. Дляэтого кровь (500-1000 мкл) смешивали с равным объемом лизирующего буфера (0,32 Мсахароза ("Merck", Германия), 5 мМ MgCl2 , 1% Тритон Х-100М, 0,1 М Трис-HCl pH 7,5 (всекомноненты "Serva", Германия)) и центрифугировали в течение 10 минут при 8 тыс. об/мин.Далее сливали надосадочную жидкость, а осадок ресуспендировали в 400 мкл буфера дляпротеиназы К (10 мМ Трис-HCl pH 10.5, 0,15 М NaCl, 1 мМ ЭДТА pH 8,0) (все комноненты"Serva", Германия). Затем к нему добавляли 10%-ый раствор додецилсульфата натрия (SDS)("Serva", Германия) доконечной концентрации 0,5% (20 мкл), а также 10 мклсвежеприготовленного раствора протеиназы К (концентрация 20 мкг/мл) ("Sigma", США) иоставляли на ночь при 37°C.

После инкубации к лизату добавляли равный объем фенола (pH8.0) ("PanreacApplichem",Испания, Германия).Смесьперемешивали15 минутицентрифугировали 5 минут при 5 тыс. об/мин. Затем осуществляли отбор водной фазы,содержащей ДНК. На следующем этапе повторяли депротеинизацию один раз со смесьюравных объемов фенола (pH 8.0) ("Panreac Applichem", Испания, Германия) и хлороформа("Компонент-Реактив", Россия) и один раз с хлороформом ("Компонент-Реактив", Россия).После чего водную фазу осаждали 2,5 объемами охлажденного 95%-го этанола ("Химзаказ",Россия) в присутствии 0,2 M ацетата Na и оставляли на час при -70°С для формирования осадка.46Далее осторожно сливали этанол, а преципитат ДНК дважды промывали в 1 мл охлажденного70%-го этанола и собирали центрифугированием 10 минут при 12 тыс.