Автореферат (Молекулярно-генетические аспекты развития гестоза у женщин северо-западного региона Hоссии), страница 3

Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, подбирали сиспользованием программ Oligo v.6.31 (Molecular Biology Insights Inc., США) и BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).Анализ образцов малых РНК. Анализ содержания малых РНК проводили с помощьютехнологии полногеномного секвенирования, используя секвенатор Ion Torrent PGM («Lifetechnologies», США). Библиотеки кДНК-копий малых РНК были приготовлены по протоколунабора «Ion Total RNA-Seq Kit v2» («Life technologies», США). Секвенирование проводили,используя набор реагентов «Ion PGM™ Sequencing 200 Kit» («Life technologies», США) имикрочип «Ion 318™ Chip» («Life technologies», США).Статистическая обработка данных. Обработку результатов исследования проводили сиспользованием программ STATISTICA v.10.0 (США), GraphPad Instat v.3.05 (США), MedCalcv.16.8.4 (Бельгия) и MDR 2.0.

beta 8.4 (США). Статистическую значимость различий междуанализируемыми группами по качественным признакам оценивали с помощью двустороннеготочного теста Фишера [Гланц, 1999]. Для сравнения распределений частот генотипов междуанализируемыми группами использовали критерий χ2 Пирсона [Гланц, 1999]. Для поискасочетаний вариантов исследуемых полиморфных сайтов, ассоциированных с риском развитиягестоза, использовали метод снижения многомерной размерности MDR (Multifactor DimensionalityReduction) [Ritchie M.D. et al., 2003]. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Припопарном сравнении нескольких групп беременных использовали поправку Бонферрони (р cor)[Гланц, 1999]. Статистически значимыми считали различия при скорректированном значенииpcor<0,05. Для оценки ассоциаций аллелей, генотипов или сочетаний генотипов по исследованнымполиморфным сайтам с патологическим фенотипом вычисляли коэффициент соотношенияшансов (odds ratio – ОШ). Соотношение шансов указывали с 95%-м доверительным интервалом(95%ДИ) [Гланц, 1999].

Прогностические возможности генетических маркеров, показавшихассоциацию с гестозом, оценивали по величине AUC (площадь под ROC-кривой) [Румянцев и др.,2009]. Величину AUC интерпретировали согласно экспертной шкале [Румянцев и др., 2009]. Дляполученных значений AUC указывали границы 95%ДИ. Сравнение количественных показателеймежду анализируемыми группами проводили после проверки на нормальность распределения ихзначений (критерий Шапиро-Уилка). Для показателей с нормальным распределением присравнении трех групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (F-критерий Фишера).Значимость различий между двумя группами проверяли с помощью критерия Стьюдента.

Приотклонении от нормального распределения, для сравнения трех групп использовали тест8Краскела-Уоллиса (H), различия между двумя группами оценивали при помощи критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05 [Гланц, 1999]. Для качественныхпризнаков слева и справа от доли (%) в виде подстрочных индексов указаны границы 95%ДИ, длянормально распределенных количественных величин приведены среднее значение и 95%ДИсреднего (±1,96*ошибки среднего), для количественных величин, распределение которыхотличается от нормального, приведены медиана и интерквартильный интервал (25-й и 75-йпроцентили).Анализ результатов секвенирования. Анализ производили с помощью программногокомплекса CAP-miRSeq (Comprehensive Analysis Pipeline for deep microRNA sequencing) [Sun et al.,2014] на базе кафедры компьютерных технологий Федерального государственного автономногообразовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский национальныйисследовательский университет информационных технологий, механики и оптики».

Длясравнительного анализа содержания микроРНК использовали программный пакет edgeR[Robinson et al., 2010]. Поправку на множественные сравнения проводили с помощью методаБенжамини–Хохберга [Benjamini and Hochberg, 1995]. Статистически значимым считалиизменение уровня содержания микроРНК при скорректированном значении pcor<0,05. Для каждоймикроРНК рассчитывали FC (fold change – кратность изменения содержания микроРНК вплацентах пациенток с гестозом по сравнению с женщинами без осложнений беременности) иlog2FC [Sun et al., 2014].РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВ результате исследования получены новые данные о связи вариантов полиморфных сайтовгенов системы свертывания крови, регуляции АД, функционирования эндотелия и метаболизмалипидов с развитием гестоза, а также сведения об изменении содержания микроРНК в плацентепри гестозе у женщин, проживающих на территории Северо-Западного региона России.СВЯЗЬ ВАРИАНТОВ ИССЛЕДУЕМЫХ ПОЛИМОРФНЫХ САЙТОВ С РАЗВИТИЕМГЕСТОЗАОсобенности ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов с риском гестозаи его отдельных клинических форм.

Исследование состояло из нескольких этапов. Сначала былвыполнен анализ ассоциации вариантов всех исследуемых полиморфных сайтов с риском гестозав целом. Далее был проведен анализ ассоциации исследуемых генетических вариаций сотдельными клиническими формами патологии в зависимости от степени тяжести, уровня АД ипротеинурии, срока манифестации и наличия фоновых заболеваний.

На заключительном этапебыло выполнено объединение результатов анализа ассоциаций.1. Ассоциация вариантов исследуемых полиморфных сайтов с риском гестоза. Припроведении сравнительного анализа частот генотипов и аллелей вариантов исследуемыхполиморфных сайтов между группами пациенток с гестозом и женщин без осложненийбеременности для вариантов 4-х генов были показаны статистически значимые различия (таблица2). Так, протективный генотип АА rs6046 гена F7 (10976G>A) не встречался у пациенток сгестозом (0,00,00,0%), но был обнаружен у 4 (0,14,07,9%) женщин без осложнений беременности(p=0,0275; ОШ=0,07; 95%ДИ:0,00-1,40). Выявлены различия в распределении частот генотипов поrs1799768 гена PAI1 (-675 5G>4G): у больных с гестозом чаще, чем в группе сравнения встречалсягенотип 5G4G (49,657,365,0% против 32,742,452,1% в группе сравнения) (p=0,0215; ОШ=1,82;95%ДИ:1,10-3,03), тогда как в группе сравнения доминирующими по частоте оказалисьгомозиготы 5G5G (17,626,335,0% против 9,214,720,2% в группе пациенток с гестозом) (p=0,0332;ОШ=0,48; 95%ДИ:0,26-0,90).

В группе с гестозом наблюдалось повышение частот генотипа CC(22,830,137,4%) и аллели C (47,352,958,5%) rs1109104 гена AGTR2 (3123A>C) по сравнению с выборкойженщин без осложнений беременности (8,916,223,5% и 36,543,450,3%) (p=0,0162; ОШ=2,23;95%ДИ:1,18-4,22 и p=0,0447; ОШ=1,47; 95%ДИ:1,02-2,10). Анализ rs1801133 гена MTHFR(677C>T) показал, что генотип CC превалировал в группе сравнения (48,958,668,3% против36,143,951,7% в группе пациенток с гестозом) (p=0,0290; ОШ=0,55; 95%ДИ:0,33-0,92), тогда как упациенток с гестозом наблюдалось повышение частоты генотипа CT (41,349,156,9% против24,934,343,7% в группе сравнения) (p=0,0275; ОШ=1,84; 95%ДИ:1,09-3,09).9Таблица 2 - Частоты генотипов и аллелей полиморфных сайтов генов F7 rs6046 (10976G>A),AGTR2 rs11091046 (3123A>C), PAI1 rs1799768 (-675 5G>4G) и MTHFR rs1801133 (677C>T) висследуемых группахГен, полиморфныйсайт (нуклеотиднаязамена или делеция)Группа пациенток сГруппагестозомсравненияpn%n%GG116750,332775,381,788,167,475,884,2GA2618,32020,20,740911,924,712,328,1F7 rs6046AA00,044,00,02750,00,00,17,9(10976G>A)G25890,817085,987,494,281,090,80,1061A26285,99,212,59,214,119,05G5G23260,03329,214,720,217,626,335,05G4G9057,34242,40,021549,665,032,752,1PAI1 rs17997684G4G4428,03131,30,576221,035,022,240,4(-675 5G>4G)5G1369437,843,348,840,547,554,50,36324G17810451,256,762,245,552,559,5AA37290,382017,424,231,020,229,338,4CA70540,197637,845,753,644,654,564,4AGTR2 rs11091046CC46160,016222,830,137,48,916,223,5(3123A>C)A14411241,547,152,749,756,663,50,0447C1628647,352,958,536,543,450,3CC69580,029036,143,951,748,958,668,3CT77340,027541,349,156,924,934,343,7MTHFR rs1801133TT1171,00003,07,011,02,07,112,2(677C>T)C21515063,468,573,669,875,881,80,0881T994826,431,536,618,224,230,2Примечание - жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (p<0,05, точныйтест Фишера), цветом выделены ячейки со статистически значимыми различиями (p<0,05) враспределении частот генотипов, полученными при сравнении группы больных с группой сравнения(критерий χ2), слева и справа от значений частот в виде подстрочных индексов указаны границы95%-го доверительного интервала (95%ДИ).Генотип,аллель2.

Ассоциация вариантов исследуемых полиморфных сайтов с гестозом разной тяжести.Согласно Российской классификации 2005 года [Материалы форума “Мать и дитя”, Москва, 2005г.] группа с гестозом включала 40 (25,5%) пациенток с гестозом средней степени тяжести, 52(33,1%) - с гестозом тяжелой степени и 65 (41,4%) - с явлениями преэклампсии.При анализе ассоциаций вариантов исследуемых полиморфных сайтов с гестозом разнойтяжести статистически значимые различия были выявлены только для распределения частотгенотипов rs11091046 гена AGTR2 (3123A>C) между подгруппой пациенток с гестозом тяжелойстепени и группой сравнения.