Автореферат (Молекулярно-генетические аспекты развития гестоза у женщин северо-западного региона Hоссии), страница 2

Далее с помощью ассоциативного метода изучена связь вариантов исследованныхполиморфных сайтов с развитием гестоза. На первом этапе проведен анализ ассоциации этихвариантов с риском гестоза и его отдельных клинических форм. На втором этапе проведен анализсовместного влияния исследуемых изменений на риск развития гестоза в целом и его отдельныхклинических форм в частности.

На заключительном этапе изучена связь всех исследуемыхизменений нуклеотидной последовательности с вариабельностью 44-х клинико-лабораторныхпоказателей при гестозе.С целью анализа содержания микроРНК при гестозе проведено секвенирование кДНК-копиймалых РНК, выделенных из образцов плацентарной ткани от пациенток с гестозом и женщин безосложнений беременности. Далее выполнен сравнительный анализ полученных данных спомощью методов биоинформатики.Положения, выносимые на защиту:1. Варианты полиморфных сайтов генов системы свертывания крови, регуляцииартериального давления, функционирования эндотелия и метаболизма липидов, ассоциированы сразвитием гестоза у женщин, проживающих в Северо-Западном регионе России.2.

Определенные варианты исследуемых полиморфных сайтов и их сочетаний влияют на рискразвития гестоза.3. Существуют различия в ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов и ихсочетаний с риском гестоза в зависимости от клинических особенностей и фоновых заболеваний.4. Исследуемые вариации ДНК ассоциированы с клиническими и биохимическимипоказателями у беременных с гестозом.5. Плаценты от женщин с гестозом и без осложнений беременности отличаются посодержанию микроРНК.Степень достоверности и апробация результатов.

Исследование выполняли сиспользованием современных молекулярно-генетических методов, включая «Кардио-Биочип» и«Фибр-Биочип» («Биочип-ИМБ», Москва) с высокой точностью анализа. Для «Кардио-Биочипа»она составляет 99,0% [Глотов, 2005], для «Фибр-биочипа» - 99,8%. В ходе анализа полиморфизмадлин рестрикционных фрагментов, использовали контрольные образцы ДНК, результатыгенотипирования для которых были подтверждены секвенированием. Для анализа содержаниямикроРНК в образцах плаценты использовали технологию ионного полупроводниковогосеквенирования на приборе Ion Torrent PGM («Life technologies», США).

Точность анализасоставляет 99,5%. На всех этапах эксперимента (подготовка образцов к секвенированию)проводили контроль качества согласно инструкциям фирмы-производителя. Образцы, неотвечающие требованиям протоколов, исключались из исследования. Основные выводы работыобоснованы и полностью соответствуют полученным результатам. Достоверность выводовподтверждается корректной статистической обработкой данных.Результаты были доложены на XX-ом Международном конгрессе по генетике (Berlin, 2008),на Европейских конгрессах по генетике человека (Barcelona, 2008; Amsterdam, 2011), на VI Съездероссийских медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), на 1-ом международном семинаредля молодых учёных Балтийского региона (Tartu, 2010), на II-ой Всероссийской научнопрактической конференции «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии»(Курск, 2011), на V Всероссийской конференции «Пренатальная диагностика и генетическийпаспорт – основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012),на VI-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону,62014), на научных семинарах лаборатории пренатальной диагностики наследственных иврожденных заболеваний человека ФГБНУ «НИИ АГиР им.

Д.О. Отта».По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 10 статей визданиях, рекомендованных ВАК.Работа поддержана грантами для студентов, аспирантов, молодых учёных, молодыхкандидатов наук вузов и академических институтов, расположенных на территории СанктПетербурга. Работа также проводилась в рамках государственных тем НИР, выполняемых вФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта».Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 180 страницах и включает«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение»,«Заключение», «Выводы», «Список литературы» (339 источника) и «Приложения А и Б». В текстепредставлено 40 таблиц и 21 рисунок.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯДля исследования ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов с развитиемгестоза были собраны образцы венозной крови двух групп женщин.

Основная группа включала157 женщин с гестозом, которые наблюдались и родоразрешались в ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта» с 2007 по 2014 год. В группу сравнения вошли 99 женщин с неосложненнойбеременностью, которые наблюдались и родоразрешались в родильном доме № 18 г. СанктПетербурга в 2010 году.Для поиска микроРНК, ассоциированных с гестозом, были использованы образцы биоптатовплацент, взятых во время операции кесарева сечения у 5 пациенток с гестозом и 6 женщин, чьябеременность протекала без осложнений.

Все образцы были получены в родильных отделенияхФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» в 2014 году.В работе была использована Российская классификация гестоза, принятая на Всероссийскомфоруме акушеров-гинекологов «Мать и дитя» в 2005 году [Материалы форума “Мать и дитя”,Москва, 2005 г.]. Диагноз гестоз устанавливали при наличии не менее двух клиническихпроявлений в следующих сочетаниях: повышение артериального давления (АД) (≥130/85мм.рт.ст.) и отеки, протеинурия (≥0,033 г/л), сопровождающая повышением АД, а такжеклассической триады симптомов - отеки, гипертензия, протеинурия. При анализе историй родов иноворожденных обращали внимание на возраст, фоновую патологию, осложнения настоящейбеременности, родов и послеродового периода, срок родоразрешения, показатели состоянияздоровья новорожденных, отеки, показатели АД и протеинурии. Краткая характеристикаисследуемых групп представлена в таблице 1.Таблица 1 - Характеристика групп беременныхГруппы/параметрВозраст, летСистолическое АД, мм.рт.ст.Анализ ДНКГруппаГруппапациенток ссравнения (n=99)гестозом (n=157)27,0 (25,0-30,0)30,0 (26,0-34,0)110,0 (110,0150,0 (140,0115,0)160,0)70,0 (70,0-70,0)90,0 (90,0-100,0)0,0 (0,0-0,0)0,07 (0,03-0,56)18 (10,618,225,8)157 (100,0100100,0)40,5 (39,5-41,0)37,5 (35,8-38,5)3591,9±78,83012,1±143,552,0 (51,0-54,0)50,0 (47,0-52,0)Анализ микроРНКГруппаГруппапациенток ссравнениягестозом (n=5)(n=6)35,0±4,729,3±1,2160,0±17,4108,3±6,1Диастолическое АД, мм.рт.ст.70,8±5,3100,0±10,8Протеинурия, г/л0,0±0,00,6±0,4Отеки, n (%)0 (0,00,00,0)5 (100,0100,0100,0)Срок родов, недели36,3±2,738,8±0,4Вес новорожденных, г2724,0±961,23410,0±244,0Рост новорожденных, см47,6±5,151,2±1,0Наличие фоновых54 (44,754,564,4)1 (-13,216,746,5)150 (92,395,598,8)5 (100,0100100,0)заболеваний, n (%)Примечание - жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (p<0,05), АД –артериальное давление, для качественных признаков слева и справа от доли (%) в виде подстрочныхиндексов указаны границы 95%-го доверительного интервала (95%ДИ), для нормально распределенныхколичественных величин приведено среднее значение и указан 95%ДИ (±1,96*ошибки среднего), дляколичественных величин, распределение которых отличается от нормального, приведены медиана иинтерквартильный интервал (25-й и 75-й процентили).7С целью оценки влияния изменений в последовательности исследуемых генов на клиниколабораторные показатели у пациенток с гестозом были изучены результаты лабораторныхисследований в третьем триместре до начала терапевтических мероприятий.

Учитывалирезультаты биохимического анализа крови, показатели состояния системы свертывания крови,активации внутрисосудистого свертывания крови и плазмнемии, содержание маркеровдисфункции эндотелия и показатели липидного обмена.Все обследованные являлись жительницами Северо-Западного региона России и былирусскими по этнической принадлежности.Выделение нуклеиновых кислот. ДНК из венозной крови выделяли фенольным методом[Sambrook et al., 1989]. Малые РНК, включая микроРНК, выделяли из плацентарной ткани спомощью набора «PureLink miRNA Isolation Kit» («Life Technologies», США).Анализ образцов ДНК. Для анализа полиморфных сайтов генов REN rs2368564, AGT rs699,AGTR1 rs5186, AGTR2 rs11091046, BKR2 rs1799722, ADRB2 rs1042713 и rs1042714, MTHFRrs1801133 использовали набор реагентов «Кардио-Биочип» («Биочип-ИМБ», Россия).

Для анализаполиморфных сайтов генов F5 rs6025, F2 rs1799963, FGB rs1800790, ITGB3 rs5918, PAI1rs1799768 и MTHFR rs1801133 был разработан «Фибр-Биочип» [Вашукова и др., 2008; Вашуковаи др., 2011]. При разработке «Фибр-Биочипа» использовали алгоритм создания биочипов,предложенный в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН совместно сФГБНУ «НИИ АГиР им. Д. О. Отта» [Глотов, 2005]. Исследование полиморфных сайтов генов F7rs6046, ITGA2 rs1126643, NOS3 rs1800779, LPL rs328, CETP rs3764261, APOA1 rs4938303, SCARB1rs5888 и NR1H2 rs2695121, а также верификацию результатов анализа ДНК с помощью «ФибрБиочипа» проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующимрестрикционным анализом.