Диссертация (Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет), страница 2

Нереид часто называют “живыми ископаемыми”, подчеркивая ихпреимущества над эволюционно продвинутыми, но тщательно проработанными вметодическом плане модельными объектами – дрозофилой и Caenorhabditis elegans,которые независимо утратили некоторые древние признаки, сохранившиеся визмененном состоянии даже у позвоночных. Такая ситуация делает нереид болеепредпочтительным объектом для изучения в сравнительном аспекте. В этой связиотносительно хорошо разработанными объектами среди полихет стали нереиды6Platynereis dumerilii, Alitta virens (ранее – Nereis virens), Neanthes arenaceodentata(Fischer, Dorresteijn, 2004; Kulakova et al., 2007; Winchell et al., 2010). Для них созданыпротоколы искусственного оплодотворения и получения культур развития, а такжеадаптированы современные методы выявления специфических белков и мРНК узародышей.

На P. dumerilii в последние годы начали применять технологии трансгенезаимутационногоанализа,которыеестественнонуждаютсявдальнейшемсовершенствовании. Эти обстоятельства, а также успешный многолетний опыт работыкафедры эмбриологии ЛГУ/СПбГУ на нереидах предопределил выбор объектовданного исследования.Цель и задачи исследованияЦель работы – выявить клеточные и молекулярные основы развития мезодермыу Spiralia на примере нереидных полихет Alitta virens и Platynereis dumerilii.Задачи:1. Идентифицировать у нереид и описать структурно-функциональнуюорганизацию консервативных генов, участвующих в развитии мезодермы(гомологи Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10, Piwi).2.

Изучить пространственно-временную экспрессию выделенных генов.3. Подобрать для нереид новые методы прижизненного и функциональногоанализа генов интереса для дальнейшего изучения их роли в развитиимезодермы.4. Раскрыть возможную роль MAP-киназного сигналинга в спецификации иморфогенезе мезодермы.Научная новизнаРабота выполнена с привлечением широчайшего спектра современныхметодик,ссовершенствованиемипроверкойновыхтехническихприемов.Комплексный анализ проблемы достигнут сочетанием описательных морфологических,молекулярно-генетических и функциональных подходов. При этом во главу ставиласьименно проблема ранней спецификации, паттернирования и морфогенеза мезодермы,а не анализ возможных молекулярных детерминантов и их активность наразнообразных стадиях онтогенеза. Интерпретация результатов дана в сравнительноми эволюционном аспектах на основе аналитического сопоставления исчерпывающейподборки литературных источников.7В настоящей работе у полихеты A.

virens были обнаружены и впервыепроанализированы фрагменты генов Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10 и Piwi, гомолог Twistбыл также идентифицирован и отклонирован для P. dumerilii. Из просеквенированныхучастков кДНК и гДНК были восстановлены полноразмерные последовательности,содержащие 5’ UTR, ORF и 3’ UTR для генов Twist, Evx, Vasa, и Piwi. Протяженныепоследовательности Mox и PL10 остались неполными на 3’ конце. У обеих полихетбыло обнаружено по два паралогичных гена Piwi (Piwi1 и Piwi2), для остальных геновудалось найти по одному гомологу.

Идентифицированные гены A. virens были названыAvi-twist, Avi-mox, Avi-evx, Avi-vasa, Avi-pl10, Avi-piwi1 и Avi-piwi2.Впервые для Spiralia установлена панмезодермальная тканеспецифичность Twist(на стадии гаструлы A. virens). Циркумбластопоральная активность Twist, как у A. virens,не была показана в развитии ни одного из моллюсков и аннелид ранее. В совокупностисо схожими данными, полученными на книдарии, брахиоподе и ланцетнике, наширезультаты вносят принципиальный вклад в обоснование архицеломатной гипотезывозникновения мезодермы из края бластопора.

Это положение подкрепляетсяметамерной экспрессией и Twist и нового для аннелид мезодермального маркера Moxу трохофор A. virens.Среди эррантных полихет только в нашей работе для A. virens приведеноописание экспрессии Evx, Vasa, PL10 и Piwi в мезодермальных зачатках. Подобнаяактивность PL10 у спиралий ранее была выявлена лишь у одного вида моллюсков. Вцелом, проверенный набор регуляторных генов продемонстрировал высокую степеньконсерватизма мезодермальной тканеспецифичности среди Spiralia. Это позволяет намс уверенностью включить проанализированные молекулярно-генетические факторы всоставанцестральнойпрограммыразвитиямезодермыспиралий.Изучениеэволюционных преобразований этой программы является, по нашему мнению,отправнойточкойдляобъясненияразнообразияуровнейорганизациимезодермальных тканей Spiralia.Выявленный паттерн ранней активности МАР-киназного сигналинга у A.

virensразительно отличается от такового у других представителей Spiralia. Эти приоритетныеданные для эррантных полихет говорят о коренных различиях в детерминацииклеточных линий и вторичной оси тела у аннелид и моллюсков с гетероквадрантнымспиральным дроблением. Ингибиторный анализ обнаружил новые критическиепериоды действия МАРК во время дробления A. virens. Предложенная модель8многократнойактивацииМАРКпредполагаетпоэтапнуюдетерминациюэнтомезодермы. При этом впервые показано, что МАРК на стадиях дробления отвечаетза гаструляционный морфогенез мезодермы, но не предопределяет образованиемезодермального зачатка и его молекулярную разметку.Достигнутый прогресс в методическом совершенствовании прижизненных ифункциональных подходов к изучению регуляции развития мезодермы у P.

dumeriliiявляется важным и весьма востребованным результатом. В наших пионерныхэкспериментах по трансгенезу P. dumerilii была установлена необычная активностьконструкций на основе транспозона Mos1, выражающаяся в вариабельности границвырезания и встраивания трансгена с возможностью множественной интеграцииразличных фрагментов в один геномный локус. Это помогает объяснить невысокуюэффективность трансгенеза P. dumerilii с использованием Mos1 и выбрать болееперспективные технологии. Автором впервые проделан трансгенез с рекомбинантнойВАС, содержащей геномный локус A. virens, обеспечивший рекапитуляцию экспрессиигена интереса у P.

dumerilii. Благодаря адаптации совершенно нового метода обратнойгенетики,полученыTALEN-индуцированныемутации,дающиевозможностьпроанализировать функцию Pdu-twist.Теоретическая и практическая значимость работыПолученные результаты важны для понимания молекулярного профилямезодермыидентичностиуспиральныхиживотных,морфогенезапутейэтогозачатка.приобретенияОпределениемезодермальнойконсервативныхуниверсальных механизмов развития позволяет реконструировать общего предкаанализируемых групп. Сравнение выявленных у нереид закономерностей с другимипредставителями первично- и вторичноротых делает возможным воссоздать обликUrbilateria – гипотетического предка всех трехслойных животных.

Сделанныеобобщения по этому поводу позволяют с большей надежностью различатьплезиоморфные (древние) и апоморфные (продвинутые) признаки, а также описыватьэволюционные события на уровне изменения активности генов и искать причинызакрепления таких регуляторных состояний.Спрактическойточкизрениячрезвычайноценныподобранныеиусовершенствованные методы молекулярно-генетических манипуляций на нереидах.Дальнейшие работы с применением трансгенеза и мутационного анализа, безусловно,будут более продуктивны с учетом представленных наработок. Последовательности9впервые клонированных для A. virens и P.

dumerilii генов загружены в базы данных,доступные для научного сообщества, и могут быть использованы для дальнейшегоанализа молекулярной эволюции семейств соответствующих генов. Результатыисследования используются в учебном процессе на биологическом факультете СПбГУ.Изложенные и опубликованные данные включены в лекционные курсы поэволюционной биологии развития и эмбриологии. Препараты экспрессии генов служатметодическимматериаломмолекулярнуюприродунапрактическихдифференцировкизанятиях,мезодермыдемонстрирующихигенетическуюобусловленность процессов развития.Методология и методы исследованияБылпримененкакописательный,такиэкспериментальныйподход.Наблюдения проводили на живом и фиксированном материале развития. Для этого попротоколу искусственного оплодотворения получали синхронные эмбриональныекультуры Alitta virens (от производителей дикого типа) и Platynereis dumerilii (отживотных дикого типа, а также из инбредных и трансгенных линий).