Диссертация (Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет)

Санкт-Петербургский государственный университетНа правах рукописиКозин Виталий ВладиславовичРАННИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ СОБЫТИЯ ФОРМИРОВАНИЯМЕЗОДЕРМЫ У НЕРЕИДНЫХ ПОЛИХЕТ03.03.05 – Биология развития, эмбриологияДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководительк.б.н., доцентКостюченко Роман ПетровичСанкт-Петербург – 2017ОГЛАВЛЕНИЕВведение.................................................................................................................................... 4Глава 1.

Обзор литературы .................................................................................................... 131.1. Формирование мезодермальных производных в индивидуальном иисторическом развитии ...................................................................................................... 141.1.1. Зародышевые листки и гаструляция....................................................................

141.1.2. Появление мезодермы в ходе эволюции ........................................................... 161.1.3. Молекулярные механизмы миогенной дифференцировки ............................. 201.1.4. bHLH транскрипционный фактор Twist................................................................ 251.1.5.

Гомеодоменный транскрипционный фактор Mox ............................................. 391.2. Развитие мезодермы у Spiralia ................................................................................... 451.2.1. Клеточные линии и морфогенез мезодермы .....................................................

451.2.2. Соматобласт 4d и организатор у Spiralia ............................................................. 501.2.3. Экспрессия молекулярно-генетических маркеров – возможныхдетерминантов развития мезодермы аннелид и моллюсков .................................... 531.3.

Краткий обзор развития полихет как модельных объектов .................................... 59Глава 2. Материалы и методы ............................................................................................... 682.1. Использованная техника и материалы ...................................................................... 682.2. Манипуляции с живыми объектами .......................................................................... 702.3. Молекулярно-биологические методы .......................................................................

712.4. Анализ локализации белков и нуклеиновых кислот ................................................ 87Глава 3. Результаты ................................................................................................................. 913.1. Анализ структурно-функциональной организации и экспрессии геновинтереса ............................................................................................................................... 913.1.1. Twist ........................................................................................................................

933.1.2. Mox ........................................................................................................................ 1003.1.3. Evx ......................................................................................................................... 10223.1.4. Vasa и PL10 ........................................................................................................... 1063.1.5.

Piwi ........................................................................................................................ 1113.2. Разработка генетических методов прижизненного и функциональногоанализа ............................................................................................................................... 1143.2.1.

Трансгенез на основе транспозона Mos1.......................................................... 1143.2.2. Трансгенез на основе рекомбинантной BAC .................................................... 1183.2.3. Мутагенез с помощью нуклеаз TALEN ...............................................................

1223.3. Активность MAP-киназного сигналинга в эмбриогенезе ....................................... 1273.3.1. Выявление компонентов каскада MAP-киназ .................................................. 1273.3.2. Ингибиторный анализ ......................................................................................... 131Глава 4. Обсуждение результатов .......................................................................................

1354.1. Молекулярные регуляторы развития мезодермы нереид и используемыеметодические подходы для их анализа .......................................................................... 1354.2. Ранняя экспрессия Twist в мезодермальных бластомерах .................................... 1394.3. Молекулярное паттернирование мезодермы в ходе ларвального развития ...... 1424.4. Роль МАР-киназного сигналинга в формировании мезодермы ........................... 152Выводы ..................................................................................................................................

158Благодарности ....................................................................................................................... 159Литература............................................................................................................................. 1613ВведениеАктуальность и степень разработанности темы исследованияСегрегация зародышевых листков и спецификация клеточных линий являютсяодним из фундаментальных свойств многоклеточных животных.

Эти события раннегоразвития во многом предопределяют и будущий план строения в целом и его болеемелкие детали. Богатейший материал эмбриологических описаний на протяжениистолетий служил доказательной базой для эволюционных построений. Поискконкретных механизмов развития, начатый эмбриологами-экспериментаторами, вомногом обеспечил прогресс молекулярной и клеточной биологии прошлого века.Сегодня достижения молекулярно-генетической отрасли биологии делают возможнымпо-новому взглянуть на феномены индивидуального и исторического развития живыхорганизмов. Стало возможным и чрезвычайно востребованным всестороннее изучениене только ограниченного числа модельных объектов, но и тех групп, в развитиикоторых существуют уникальные, а зачастую и парадоксальные закономерности.К группе Spiralia в эмбриологическом понимании относят аннелид, моллюсков,немертин и плоских червей.

В основном все они характеризуются стереотипнымпаттерном дробления с ранней сегрегацией зародышевых листков и клеточных линий,что внешне проявляется телобластическим способом формирования различныхзачатков, в том числе и мезодермы. Потрясающий консерватизм развития спиралийсостоит в гомологии расположения и судьбы многих бластомеров у зародышейдальнеродственных животных. Вместе с тем, на более поздних стадиях развития в рядуSpiralia наблюдается большое разнообразие, от паренхиматозных планарий сресничнойлокомоциейдораковинныхмоллюсков,обладающихпоперечнополосатыми мышцами. Даже в пределах типа Annelida развитие можетвключать стадию свободноживущей личинки трохофоры, превращающейся в процессеметаморфоза в ювенильного червя (как это происходит у “Polychaeta”) или бытьпрямым, когда из яйцевых оболочек вылупляется молодой червь, а не личинка (как уолигохет и пиявок – представителей Clitellata). Как объяснить это противоречивоесочетание внешне единообразного высоко детерминативного эмбриогенеза иразительно отличающихся взрослых форм? Решать этот актуальнейший вопрос следуетне только на морфологическом и клеточном уровне, но и с привлечением современныхмолекулярно-генетических и функциональных методов анализа развития.4Spiralia (в современной макрофилогении – синоним клады Lophotrochozoa)являются крупнейшей, но до сих пор скудно изученной в генетическом аспекте ветвьюBilateria.

Важнейшим эволюционным приобретением раннего развития трехслойных(=Bilateria) было обособление отдельного мезодермального листка. Молекулярнойосновой этой инновации считают вычленение миогенных факторов из общеймезэнтодермальнойпрограммы,приобретениеимисамостоятельностиисамодостаточности с последующей дивергенцией сложившейся мезодермальнойгенной регуляторной сети (Martindale, 2005; Козин, Костюченко, 2016). Какэволюционноболеемолодой,мезодермальныйлистокимеетнаибольшуювариабельность в механизмах своего формирования в разных филогенетическихлиниях. Популярно мнение о том, что появление мезодермы в эмбриогенезе Bilateriaво многом обеспечило взрывообразный рост числа планов строения тела в раннемкембрии (Martindale et al., 2004; Burton, 2008).

Вместе с тем, такие принципиальныевопросы, как клеточные и молекулярные механизмы формирования мезодермы вэмбриогенезе и постларвальном развитии (при метаморфозе и регенерации) многихживотных,поканенашлирешения.Темважнеестановитсякомплексноесравнительное изучение развития именно мезодермы, что должно приблизить кпониманию путей эволюции и создания современного биоразнообразия.Клеткой-родоначальницейтуловищноймезодермы(энтомезодермы)большинства спиралий является второй соматобласт – 4d. В результате равногоделения 4d образуются два мезотелобласта, при пролиферации которых появляютсябилатерально-симметричные мезодермальные полоски.

В основном, представления охарактерепролиферациииформообразованияэнтомезодермыспиралийосновываются на описаниях небольшого числа объектов с экстраполяцией на всюгруппу, что нельзя признать обоснованным в современных реалиях. В последние годы,с целью определения степени эволюционного консерватизма развития мезодермы,были детально изучены клеточные линии энтомезодермы у некоторых аннелид(Helobdella, Tubifex, Capitella, Platynereis) и моллюсков (Ilyanassa, Crepidula) (Rabinowitzet al., 2008; Meyer et al., 2010; Gline et al., 2011; Lyons et al., 2012; Fischer, Arendt, 2013).Эти работы сделали еще более явными различия в раннем развитии мезодермыданных видов. Оказалось, что классические представления, изложенные в учебныхруководствах, несводимы и неприложимы к большинству известных к сегодняшнемудню паттернов развития.5Кроме выяснения судьбы клеточных клонов и картирования зародышей Spiralia,в настоящий момент первостепенной задачей является идентификация конкретныхучастников программ развития, обеспечивающих спецификацию и последующеепаттернирование зародышевых листков.

Благодаря ряду разрозненных исследований,в производных энтомезодермы – мезодермальных полосках трохофоры – у моллюсковHaliotis и Ilyanassa была обнаружена дифференциальная экспрессия генов Mox, Nanos,Vasa, PL10 (Hinman, Degnan, 2002; Rabinowitz et al., 2008; Kranz et al., 2010), у полихетыCapitella – гомологов Twist, Hairy, Evx, Runx (Dill et al., 2007; Thamm, Seaver, 2008; Seaveret al., 2012), равно как Nanos и Vasa (Dill, Seaver, 2008). Большое внимание уделяетсявозможному участию MAP-киназного сигналинга и канонического Wnt/β-катениновогопути в раннем развитии бластомеров с мезодермальной судьбой (Lambert, Nagy, 2001;Henry, 2014). Подобные пионерные исследования очертили круг возможныхмолекулярныхучастниковмезодермальнойгеннойрегуляторнойсетиупредставителей Spiralia.

Однако определенных закономерностей и очевидныхгомологий пока выявить не удается, а порой противоречивость данных делает картинураннего развития спиралий еще более запутанной, чем казалось ранее. Очевидно,такая ситуация требует целенаправленного сравнительного изучения конкретныхаспектов развития на ряде родственных объектов и более тщательный подбор новыхмодельных организмов.Одной из успешно разрабатываемых моделей среди Spiralia являютсянереидные полихеты (сем. Nereididae), которые дошли до наших дней в относительномалоизмененномсостояниииобладаютмножествомдревнихпризнаков.Консервативными признаками, унаследованными от общего предка билатеральныхживотных, принято считать раннекембрийское происхождение, обитание в морскойсреде, план строения сегментированного тела, амфистомию, определенный наборсемейств генов, соотношение паттернов их экспрессии и ряд особенностейорганизации генома.