Диссертация (Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет), страница 3

В зиготы P.dumerilii с помощью микроинъекций доставляли различные мРНК и ДНК. При фиксациистадий развития использовали сотни объектов. Выявление специфических эндогенныхбелков и мРНК в клетках зародышей и личинок проводили на тотальных препаратах попротоколу иммуноцитохимии и молекулярной гибридизации in situ (whole mount in situhybridization, WMISH).Среди молекулярно-биологических методик использовали: выделение мРНК,обратную транскрипцию, клонирование генов, рестрикционный анализ, блоттинг игибридизацию по Саузерну, транскрипцию in vitro, конструирование репортерныхтрансгенов и сайт-специфических нуклеаз TALEN, рекомбинацию бактериальныхискусственных хромосом (ВАС), проверку активности транспозазы в клеткахзародышей.

Среди различных вариантов полимеразной цепной реакции (ПЦР) былиПЦР со специфическими праймерами на кДНК и гДНК, вырожденная ПЦР, гнездоваяПЦР,тачдаун-ПЦР(touchdownPCR),полуколичественнойПЦРсобратнойтранскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR), TAIL-ПЦР (Thermal Asymmetric Interlaced PCR).Широкое применение получили методы анализа in silico, включая моделированиефилогенетических схем, предсказание структуры генетических локусов, аннотированиепоследовательностей мРНК и белков.10Для оценки значимости молекулярных событий применяли методологию“утратафункции”(loss-of-function).МАР-киназныйсигналингподавлялифармакологическим агентом U0126.

Зародышей инкубировали в растворе ингибитораи анализировали результаты прижизненно, а также с помощью гибридизации in situ,морфометрии и статистической обработки. Нокаут гена Pdu-twist проводили спомощью TALEN-индуцированного мутагенеза.Положения, выносимые на защиту1. В геномах нереид A. virens и P. dumerilii присутствуют консервативные дляSpiralia мезодермальные регуляторные факторы – гомологи генов Twist,Mox, Evx, Vasa, PL10, Piwi.2.

Эти факторы дифференциально экспрессируются в ходе эмбриональногои личиночного развития A. virens, придавая мезодермальным клеткамуникальное регуляторное состояние.3. На стадиях дробления у нереид выявлены активные компоненты МАРкиназногосигнальногопути,которыеважныдляморфогенезамезодермальных полосок.4. Впервые опробованные на P. dumerilii генетические методы (трансгенез имутагенез)исформулированныеметодическиерекомендацииоткрывают качественно новые возможности исследования мезодермы уSpiralia.Степень достоверности и апробация результатовРезультаты и выводы работы имеют высокую степень достоверности, посколькуполучены с помощью комплекса разных методов на двух объектах (A.

virens и P.dumerilii) с применением повторностей, контролей и статистической обработки.Журнальные публикации автора прошли тщательное рецензирование и активноцитируются.Полученные данные опубликованы в 12 работах. Из них 4 статьи вспециализированных изданиях (“Известия РАН. Серия биологическая”, “Mechanisms ofDevelopment”, “Development Genes and Evolution”, “PLoS ONE”), рекомендованных ВАКи индексируемых WoSCC и Scopus, в том числе 3 на английском языке, и 8 тезисовконференций. Автором работы были сделаны устные доклады на III Конференциимолодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012 г.), на Всероссийскойконференции с международным участием “Эмбриональное развитие, морфогенез и11эволюция” (Санкт-Петербург, 2013 г.), на Международном V съезде ЕвропейскогоОбщества Эволюционной Биологии Развития (Вена, Австрия, 2014 г.), на Всероссийскойконференции “Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: устойчивостьи вариабельность” (Москва, 2015 г.), на III Всероссийской конференции смеждународным участием “Современные проблемы эволюционной морфологииживотных” (Санкт-Петербург, 2016 г.), а также на научных семинарах кафедрэмбриологииизоологиибеспозвоночныхбиологическогофакультетаСПбГУ.Стендовые доклады представлялись на Международной конференции “Современныеметоды микроскопии в биологии и медицине” (Санкт-Петербург, 2009 г.), наМеждународной научной конференции “Каспар Фридрих Вольф и современнаябиология развития” (Санкт-Петербург, 2009 г.), на Международном IV съездеЕвропейского Общества Эволюционной Биологии Развития (Лиссабон, Португалия,2012 г.).12Глава 1.

Обзор литературыСегрегация зародышевых листков и спецификация клеточных линий являютсяодним из фундаментальных свойств многоклеточных организмов. Эти события раннегоразвития во многом предопределяют и будущий план строения в целом и его болеемелкиедетали.Ужевовторойполовине20-говеканачавшийсясинтезэкспериментальной эмбриологии и генетики привел к выводу, что определениеклеточной судьбы в эмбриогенезе обусловливается изменениями дифференциальнойэкспрессии генов в различных клеточных линиях развивающегося зародыша (Davidson,1976; Raff, Kaufman, 1983).Развитие (в норме) сопровождается прогрессивным ограничением клеточныхпотенций.Недифференцированныеклеткипоследовательнопретерпеваютспецификацию (обратимое состояние), детерминацию (необратимое изменение) испециализацию (терминальная дифференцировка).

Спецификация клетки может бытьуточненавходеразвития,когдасначалаопределяетсясудьбавсегоморфогенетического поля – группы клеток, дающих определенный зачаток, – авпоследствии в его составе сформируются различные клеточные типы. В случаеизоляции или пересадки еще недетерминированной клетки, ее судьба может бытьлегко изменена под влиянием окружения. Будучи помещенной в нейтральные условия,такая клетка дифференцируется в соответствии с первоначально приобретеннойспецификацией. Детерминация же является, как правило, необратимым состоянием иопределяет будущую судьбу клетки независимо от внешних условий. Первые этапыпредопределения клеточной идентичности – спецификацию и детерминацию – частообъединяют под термином коммитирование (Stern, 2004; Gilbert, 2006).

В отличие откоммитированных, дифференцированные клетки приобретают морфологические (втом числе ультраструктурные) отличия, поскольку они синтезируют определенныемолекулы и уникальные субклеточные структуры, необходимые для выполненияфункции, например, миофибриллы у мышц, нейромедиаторы у нейронов, жгутики усперматозоидов.Основными феноменами развития, помимо цитодифференциации, являютсяпространственное паттернирование (региональная спецификация) и морфогенез(формообразование) (Wolpert, 1969; Slack, 2005; Дондуа, 2005).

Последние два явленияобеспечивают создание организованного трехмерного зародыша, оси и зачаткикоторого упорядочены в пространстве.13В данной главе будут изложены классические представления о механизмахразвития и современное состояние проблемы формирования мезодермы в онтогенезеи эволюции. Кроме того, будут охарактеризованы важнейшие аспекты биологииразвития нереидных полихет, послуживших объектом данного исследования.1.1. Формирование мезодермальных производных в индивидуальном иисторическом развитии1.1.1.

Зародышевые листки и гаструляцияВходегаструляцииначинаетсязакономерноепреобразованиепространственной структуры зародыша – выделяются крупные клеточные домены,называемые зародышевыми листками. Еще до начала гаструляции, на стадии позднейбластулы, материал зародышевых листков принято обозначать в виде картыпрезумптивных зачатков. Поскольку клетки бластулы, в принципе, могут изменить своюсудьбу, если, к примеру, их пересадить в новое морфогенетическое поле, то до началагаструляции следует говорить именно о презумптивных зародышевых листках (Hall,1998).

Сами зародышевые листки являются зачатками комплексов тканей и органов.Согласно “принципу специфичности” одноименные зародышевые листки у разныхживотныхобладаютодинаковымнаборомпроизводных.Наружныйлисток(эктодерма) дает начало покровам тела и нервной ткани, внутренний (энтодерма) –пищеварительнойсистеме.Мезодерма,илисреднийзародышевыйлисток,дифференцируется в ткани внутренней среды, мышцы и целомический эпителий.Правильное инвариантное взаиморасположение внешнего, внутреннего и среднего(промежуточного) листков после прохождения гаструляции отвечает “принципутопографии” (Иванова-Казас, 1995; Козин, Костюченко, 2016).Согласно теории зародышевых листков у двухслойных (книдарий и гребневиков)существует два листка – наружный эктодермальный и внутренний энтодермальный(Рис.

1). Иногда последний обозначают англ. термином “endomesoderm” (Stern, 2004;Martindale, 2005; Röttinger et al., 2012), что соответствует русскоязычному понятию“мезэнтодерма” – общий зачаток мезодермальных и энтодермальных структур.Мезэнтодермой также можно назвать зачаток паренхимы Acoela (Иванова-Казас, 1995).У остальных эуметазойных животных выделяют все три листка, отсюда и названиетрехслойные. Хотя, и у первично-, и у вторичноротых в раннем развитии почти всегда14есть бипотенциальный мезэнтодермальный зачаток с консервативными механизмамиспецификации (Rodaway et al., 1999; Rodaway, Patient, 2001).Рис. 1. Гаструла двухслойных (слева) и трехслойных животных (справа) (по Martindale,2005).

Эктодерма обозначена голубым, энтодерма – желтым, мезодерма – красным,звездочка – бластопор.В соответствии с классической точкой зрения формирование зародышевыхлистков в раннем онтогенезе Eumetazoa имеет важное филогенетическое значение,которое состоит в рекапитуляции онтогенеза далеких предков, обусловленнойсохранением (консервацией) древнейших участков программы развития (ИвановаКазас, 1995). Появление мезодермального листка у трехслойных предполагаетсерьезное преобразование старой мезэнтодермальной программы, основанное навычленении миогенных факторов из общей сети и дальнейшей дивергенции этихучастков программы (Martindale, 2005). Кроме того, мезодермальные клетки могутбыть дополнительно индуцированы в новом месте зародыша (Rodaway, Patient, 2001).Морфологическое обособление мезодермы в ходе гаструляции можетосуществляться в основном двумя альтернативными способами – телобластическимили энтероцельным (Рис.

2). Первый из них ярчайшим образом реализуется у аннелиди ракообразных, в развитии которых очень рано детерминируются бластомерымезодермальной линии. Пролиферация этих мезодермальных телобластов даетначало мезенхимным скоплениям, внутри каждого из которых схизоцельно образуетсяполость.Окружающиеполостьклеткивыстраиваютсявэпителий,образуяцеломический мешок. При энтероцельном способе, в чистом виде представленном уиглокожих и полухордовых, в определенных участках архентерона образуютсявыпячивания, и первичные целомы отпочковываются внутрь бластоцеля. Далее15первичные целомы разделяются перешнуровкой на характерное для данного видаколичество целомических мешков.Рис. 2.