Диссертация (Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет), страница 8

Стрелками обозначены домены экспрессии в основаниихетоносных мешков, звездочка – бластопор.Наиболее ранний выявленный паттерн экспрессии Twist у брахиоподыTerebratalia transversa приурочен к стенке архентерона, примыкающей к бластопору(Passamaneck et al., 2015). Эта локализация мРНК Twist связана с мезодермальнымиклетками, которые в дальнейшем развитии билатерально выстраиваются внутриапикальной лопасти и по бокам мантийной складки (Рис. 9). Передней доменэкспрессиисоответствуетголовноймезодерме(возможногомологичнойэктомезодерме), а туловищный домен прилегает к хетоносным мешкам, гдеразвиваются специализированные мышцы.

Учитывая разнообразие описанных картин34распределения продуктов Twist и особенностей модусов развития в упомянутыхтаксонах Spiralia, весьма сложно найти какие-либо общие закономерности. Наиболееконсервативной чертой следует признать участие Twist в миогенезе, а связь с болеераннимиэтапамиспецификациимезодермы(входегаструляции)можнопредположить лишь для полихет и брахиопод.Deuterostomia является третьей кладой Bilateria, у представителей которой мырассмотрим роль гомологов гена Twist в развитии. Наиболее древней группойвторичноротых являются иглокожие.У морских ежей мезодерма состоит из трех компонентов: первичноймезенхимы, вторичной мезенхимы (PMC и SMC соответственно) и целома.Предшественники первичной мезенхимы – микромеры – обособляются на 16-тиклеточной стадии дробления. Их потомки выселяются из стенки бластулы,претерпеваютингрессию(классическийпримерэпителиально-мезенхимногоперехода) и дают начало личиночному скелету.

Первичная кишка (архентерон),вторичная мезенхима и целом происходят из венца мезомеров veg2. Результатомдифференцировки SMC являются пигментные клетки, личиночные мышцы и клеточныеэлементы бластоцеля (Иванова-Казас, 1978).Экспрессия гомолога Twist у морского ежа Lytechinus variegatus выявляется спомощью гибридизации in situ в вегетативной пластинке незадолго до началавыселения из нее клеток первичной мезенхимы (Wu et al., 2007; Wu et al., 2008). Послеингрессии PMC экспрессия Lvtwist в них сохраняется.

Кроме того, после началаинвагинации вегетативной пластинки мРНК Lvtwist появляется в клетках вторичноймезенхимы и присутствует в них до конца гаструляции.В результате экспериментов с применением морфолино к гену Lvtwist(функциональный нокаут) у L. variegatus наблюдались множественные нарушения вразвитии первичной и вторичной мезенхимы (Wu et al., 2008). Ингрессия PMCпроисходила с сильным опозданием, не формировался правильный паттернличиночного скелета. Среди дефектов развития SMC было отмечено почти полноеотсутствие пигментных клеток и личиночных мышц. Кроме того, не происходилонормальной элонгации архентерона, важную роль в которой играют клеткибластоцеля.Эти и ряд других опытов, а также детальный анализ регуляторных генных сетейпозволили Ву с соавт.

(Wu et al., 2008) сделать вывод о том, что гомолог Twist играет35важную роль в разных аспектах развития мезодермы у морских ежей. Одной из егофункций является поддержание специфицированного состояния клеток первичноймезенхимы, что позволяет им правильно пройти ингрессию. На более поздних стадияхLvtwist контролирует дифференцировку как первичной, так и вторичной мезенхимы.НаблюдениезадинамикойэкспрессиигомологаTwistуланцетникаBranchiostoma belcheri tsintauense было произведено с помощью молекулярнойгибридизации in situ, начиная со стадии поздней гаструлы (Yasui et al., 1998). Уэмбрионов на этой стадии мРНК Bbtwist была обнаружена в первой парепрезумптивных сомитов и в дорсальной стенке архентерона (презумптивной хорде).Затем экспрессия Bbtwist усиливалась в латеральных стенках сомитов и в хорде.

Настадии поздней нейрулы транскрипт Bbtwist также присутствовал в передней стенкеархентерона и в эвагинирующих из него латеральных дивертикулах, которыерассматриваются рядом авторов как передние сомиты. Сигнал Bbtwist не былобнаружен в отделившемся от архентерона левом латеральном дивертикуле, тогда какв правом дивертикуле ген экспрессировался во время формирования у личинкиголовного целома. На этой же стадии сигнал мРНК Bbtwist присутствовал в переднейчасти хорды.

У более развитых личинок очень слабая экспрессия Bbtwist былазафиксирована в постериорной части дифференцирующейся хорды и параксиальноймезодермы.Из описанных паттернов экспрессии, согласно упомянутым авторам, следует, чтоTwist у бесчерепных вовлечен в раннюю дифференцировку мезодермальныхпроизводных. Предполагается, что продолжительная экспрессия Bbtwist в переднейчасти хорды отражает особенности пролиферации слагающих ее клеток, что позволилоданному органу занять столь вынесенное вперед положение в теле бесчерепных.Экспрессию Bbtwist в передней стенке архентерона авторы связывают с анцестральнойспособностью вторичноротых продуцировать мезодерму из крыши первичной кишки.Среди позвоночных животных роль Twist в развитии была исследована учетырех модельных объектов: костистой рыбы Danio rerio (Germanguz et al., 2007),лягушки Xenopus laevis (Hopwood et al., 1989; Stoetzel et al., 1998; Linker et al., 2000),курицы Gallus gallus (Scaal et al., 2001; Tavares et al., 2001) и мыши Mus musculus (Wolf etal., 1991; Stoetzel et al., 1995; Gitelman, 1997; Ota et al., 2004).

В геноме каждого из этихживотных найдено от одного до четырех гомологов гена Twist. Несмотря на36существующие различия в паттернах экспрессии этих генов, для всех позвоночныхсправедливы следующие положения:Twist достоверно начинает экспрессироваться во время гаструляции вмезодермальных клетках;на стадии органогенеза мРНК Twist выявляется в сегментационнойпластинке, эпителиальных сомитах и латеральной мезодерме;Twist контролирует миграцию и дифференцировку клеток черепногоотдела нервного гребня;на стадии хвостовой почки Twist экспрессируется в мезенхимеконечностей, жаберных дугах, а также в склеротоме и дермотомедифференцированных сомитов.Кроме того, у представителей Anamnia (рыб и амфибий), как и у ланцетника,некоторые гомологи Twist экспрессируются в организаторе, а затем и в хорде, чтосчитается анцестральным состоянием для Chordata (Yasui et al., 1998; Germanguz et al.,2007).

У птиц Twist участвуют в развитии дермы, перьев и кожных чешуй (Scaal et al.,2001; Tavares et al., 2001; Hornik et al., 2005). Гомологи Twist млекопитающих кромевсего прочего экспрессируются в мезенхиме нёба, зачатках зубов и швах костей черепа(Rice et al., 2000).Основную функцию, которую приписывают семейству Twist позвоночных,является контроль над дифференцировкой мезодермальных производных (Castanon,Baylies, 2002; O’Rourke, Tam, 2002). В частности предполагается, что экспрессиягомологов Twist в склеротоме и дермотоме предохраняет их клетки от мышечнойдифференцировки. В подтверждение этой гипотезы можно привести эксперименты, вкоторыхклеточнуюкультурумиобластовразнойстепенидифференцировкитрансфецировали соответствующим гомологом гена Twist (Hjiantoniou et al., 2008).

Врезультате таких манипуляций происходила не только остановка миогенеза, но дажедедифференцировка синцитиальных мышечных трубочек в одноядерные миобласты.Причастность Twist к развитию нервного гребня является иллюстрациейконсервативной функции этого гена в эпителиально-мезенхимном переходе.Насколько значимую роль гомологи Twist играют в процессах индукции испецификациипригаструляцииупозвоночныхпоканеясно,посколькуфункциональный анализ производился только на мышах. На основе паттернов37экспрессии можно лишь предполагать, что роль эта уменьшалась в эволюции отнизших позвоночных (Anamnia) к высшим (Amniota).Структура и механизм функционирования на молекулярном уровнеГен Twist кодирует транскрипционный фактор, относящийся к суперсемействуbasic Helix-Loop-Helix (bHLH) содержащих белков (Leptin, 1991).

basic домен богатосновными аминокислотами и специфично связывается с участком ДНК, названным Ебоксом, консенсусная последовательность которого является гексануклеотидом 5’CANNTG-3’. Мотив Helix-Loop-Helix состоит из двух α-спиралей, соединенных гибкойпетлей. Этот мотив придает способность bHLH транскрипционным факторамдимеризоваться.Twist (белковый продукт Twist) может образовывать как гомодимеры, так игетеродимеры, что обеспечивает разную афинность к регуляторным элементаммногочисленных генов-мишеней (Castanon et al., 2001; Wong et al., 2008).

В комплексе сразными партнерами Twist может выполнять функцию репрессора или активаторатранскрипции генов, содержащих Е-бокс. Важным фактором в выборе партнера длядимеризации является наличие у Twist посттрансляционных модификаций, таких какфосфорилирование (Cai, Jabs, 2005; Firulli, Conway, 2008).Благодаря способности димеризоваться, регуляция транскрипции можетосуществляться не напрямую, а опосредованно, так как, конкурируя за связывание сопределенными партнерами, Twist выбирает для них гены-мишени (в отсутствие Twist,его потенциальные партнеры образуют другие димеры и взаимодействуют с другимимишенями, транскрипцию которых напрямую Twist не регулирует).

Кроме того, Twistможет связываться с белками не только HLH мотивом. Взаимодействие basic доменовTwist и MyoD (bHLH миогенный регуляторный фактор) приводит к неспособностипоследнего активировать свои мишени и, как следствие, блокирует дифференцировкумышц у позвоночных (Hamamori et al., 1997).Давно известными мишенями Twist у дрозофилы являются гены heartless(рецептор FGF), Mef2 (консервативный фактор мышечной дифференцировки), snail(транскрипционный фактор, необходимый для эпителиально-мезенхимного перехода)и tinman (консервативный гомеодоменный транскрипционный фактор, принимающийучастие в развитии сердца).

Гомологичные мишени для Twist описаны у Caenorhabditiselegans и у позвоночных (Castanon, Baylies, 2002; Ciglar, Furlong, 2009).38Относительно недавно было показано значение Twist в механизме РНКинтерференции у дрозофилы (Sokol, Ambros, 2005). Так, Twist является необходимым идостаточным фактором для активации транскрипции microRNA-1 – еще одногоучастника мышечной дифференцировки.Исследования с использованием метода ChIP-on-chip (иммунопреципитацияхроматина с последующим микроэррей анализом) выявили у дрозофилы более 2000связывающихся с Twist цис-регуляторных модулей и почти 500 прямых генов-мишеней(Sandmann et al., 2007; Zeitlinger et al., 2007).