Диссертация (Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет), страница 9

Неожиданным оказалось то, что Twistрегулирует почти все кассеты генов, необходимые для пролиферации, и гены,участвующие в морфогенезе и клеточной миграции. Таким образом, теоретически Twistспособен контролировать почти 25% всех аннотированных транскрипционныхфакторов дрозофилы, которые могут представлять полный набор необходимыхрегуляторовраннегоразвитияэтойсистемы.Пространственно-временнаяспецифичность взаимодействия Twist с энхансерами определяется, как полагают Вонг ссоавт. (Wong et al., 2014), уровнем активности (концентрацией) Twist и контекстом(структурой энхансера, набором доступных кофакторов).Завершая раздел, посвященный транскрипционному фактору Twist, необходимообратить внимание на следующие его особенности:возникнув на заре эволюции Eumetazoa, Twist изначально был связан склеткамимезодермальнойприроды,находящимисявмалодифференцированном состоянии;у Bilateria Twist экспрессируется почти исключительно в мезодерме,причем у некоторых организмов, начиная со стадий ее спецификации;молекулярные механизмы действия транскрипционного фактора Twistобуславливают разнообразие его функций на разных этапах развития;Twist является одним из главных участников генетических программразвития мезодермы у всех Eumetazoa.1.1.5.

Гомеодоменный транскрипционный фактор MoxСтруктура и гомологиMox относится к классу гомеобокс-содержащих генов Antennapedia и кодируетсоответствующий гомеодоменный ТФ. Впервые Mox (от англ. mesoderm/mesenchymehomeobox gene) был выделен у мыши и назван так в связи со своей мезодермальной39тканеспецифичностью (Candia et al., 1992). В геноме мыши, как и других позвоночных,выявлено два паралога – Mox1 и Mox2.

Ортолог Mox2 у крысы был открыт независимои назван Gax (от англ. growth arrest-specific homeobox gene) (Gorski et al., 1993). Впоследнее время Mox гены позвоночных чаще называют аббревиатурой Meox.Расположение последовательности Mox на хромосоме тесно связано убольшинства животных с кластером Hox генов. Предполагается, что далекий предокгена Mox возник в ранней эволюции многоклеточных вследствие тандемнойдупликации одного из анцестральных (возможно, самого первого) гомеобокссодержащего гена Antennapedia класса (Minguillón, Garcia-Fernàndez, 2003). Позднеевесь protoHox кластер и ассоциированные с ним гомологи подвергся дупликации, чтодало начало наборам paraHox, Hox и Hox-связанным генам (Mox, Evx и др.) (Minguillón,Garcia-Fernàndez, 2003; Ferrier, 2012).

Таким образом, Mox не выводят отопределенного Hox или paraHox гена, отмечая их более или менее одновременноепроисхождение. Однако Mox принято включать в состав т.н. расширенного Hoxкластера (extended Hox cluster), хотя встречаются и отклонения, как например удрозофилы, гомолог Mox которой (названный buttonless) сцеплен не с Hox, а с NKкластером.У другого представителя клады Ecdysozoa – нематоды C. elegans – гомолог Moxвовсе отсутствует. У большинства беспозвоночных, в геноме встречается единственныйгомолог Mox, что является анцестральным состоянием для первично- и вторичноротых(Minguillón, Garcia-Fernàndez, 2002). У позвоночных существует два паралогичных гена:Mox1 сцеплен с HoxB кластером, а Mox2 закодирован вблизи кластера HoxA.Контрастным случаем является наличие четырех паралогов Mox у книдарий.Гены MoxA, MoxB, MoxC и MoxD у актинии Nematostella vectensis считают результатомнезависимых тандемных дупликаций, поскольку все они в хромосоме идут друг задругом и сонаправлены (Ryan et al., 2007).Тканеспецифичность и роль в развитииЭкспрессия гомологов Mox в развитии Nematostella vectensis начинается послезавершения периода гаструляции, причем паттерны экспрессии четырех геновнеотличимы друг от друга (Ryan et al., 2007).

У планул сигнал локализуется в энтодермена анимальном полюсе в виде кольца. По мере превращения личинки в полиптранскрипты Mox выявляются в узком участке глоточной энтодермы, примыкающей корту.40Единственными представителями Spiralia, у которых была изучена экспрессияMox, являются брюхоногие моллюски рода Haliotis. По данным RT-PCR транскрипцияMox начинается у Haliotis rufescens на стадии личинки трохофоры и продолжаетсядлительное время после метаморфоза (Degnan et al., 1997). Пространственноераспределение мРНК Mox у трохофоры Haliotis asinina приурочено ко внутренниммезодермальным клеткам, организованным в виде двух билатерально-симметричныхполос (Hinman, Degnan, 2002). К сожалению, из-за слабой изученности эмбриологииHaliotis увязать паттерн экспрессии с конкретной клеточной линией (с экто- илиэнтомезодермой) авторам не удалось. У более зрелых личинок (велигеров) Moxэкспрессируется в клетках, формирующих мускулатуру ноги, причем многочисленныемышечные волокна уже выявляются в ноге на этой стадии (Hinman, Degnan, 2002).Изучение гомолога Mox дрозофилы, известного как buttonless, показалоисключительнозиготическуюегоэкспрессию,начинающуюсясостадийсегментированной зародышевой полоски.

Транскрипты buttonless были обнаружены вотдельной линии клеток под названием DM (dorsal median), пара которых лежит вдольдорсомедиальной границы ЦНС в каждом грудном и брюшном сегменте (Chiang et al.,1994). DM клетки своими латеральными отростками соединяют левую и правую частимезодермы и сами также принадлежат к этому зародышевому листку. При мутацииbuttonless DM клетки специфицируются (что проявляется в запуске экспрессия самогоbuttonless), но их дальнейшая дифференцировка (и поддержание экспрессииbuttonless) не происходит, и этот клеточный тип не формируется. Фенотипическимутация также проявляется в нарушении направленного роста аксонов медианного ипоперечных нервов, что указывает на роль DM клеток в этом процессе.

Как выяснилосьпозднее, за активацию buttonless у дрозофилы ответственен гомеобокс-содержащийген NK-кластера tinman (Yin, Frasch, 1998).Mox у Saccoglossus kowalevskii (Hemichordata) начинает экспрессироваться послеокончаниягаструляции,когдацеломическиемешкиужеотпочковалисьотархентерона. В этот период сигнал Mox отмечен исключительно в парном целомеметасомы (Lowe et al., 2006).

На более продвинутых стадиях экспрессия в дорсальнойчасти метацелей ослабевает, так что к третьему дню развития она наблюдается впределах узкой вентромедиальной полоски мезодермальных клеток мета- имезосомы. Следует отметить, что вентральная сторона у S. kowalevskii соответствуеттаковой у первичноротых (Lowe et al., 2006).41У другого вторичноротого беспозвоночного – ланцетника – в отличие отостальных хордовых был найден только один гомолог Mox. Этот ген экспрессируется уBranchiostomafloridaeнапереднемконцепресомитноймезодермыивновообразованных сомитах (Minguillón, Garcia-Fernàndez, 2002). Почти сразу послеформирования каждого из сомитов экспрессия в нем начинает затухать вплоть до ееполного исчезновения при отделении последующего метамера.

Кроме того, начиная состадии пяти сомитов, в их расположении и паттерне экспрессии Mox прослеживаетсяявная лево-правая асимметрия, при которой метамеры левой стороны формируютсянемного раньше и лежат ростральнее относительно правых. На более поздних стадияхэмбриогенеза Mox экспрессируется во внутренних клетках хвостовой почки.У позвоночных животных от рыб до млекопитающих гомологи Mox проявляютустойчивую тканеспецифичность, приуроченную к сомитам и их производным (Candiaet al., 1992; Candia, Wright, 1995; Candia, Wright, 1996; Neyt et al., 2000; Rallis et al., 2001).У амниот Mox1 начинает экспрессироваться при гаструляции в ранних мезодермальныхклетках, а затем мРНК локализуется в пресомитной мезодерме и сомитах, у мыши –повсеместно с наиболее интенсивным сигналом в каудальных доменах склеротомов(Candia et al., 1992; Candia, Wright, 1996), а у курицы – только в дермомиотомах(Reijntjes et al., 2007).

Транскрипты Mox2 появляются заметно позже – в эпителиальныхсомитах, а во время дифференциации сомита сильнее всего соответствующие гомологии у мыши, и у курицы экспрессируются в клетках склеротома (Candia, Wright, 1996; Ralliset al., 2001). Оба паралога Mox также имеют пересекающиеся, но неидентичныедомены экспрессии в почке конечности высших позвоночных (Candia, Wright, 1996;Reijntjes et al., 2007). Кроме того, у млекопитающих активность Mox2 обнаружена вкардиомиоцитах,сердечнойтрубке,гладкомышечныхклеткахиэндотелиикровеносных сосудов (Gorski et al., 1993; Skopicki et al., 1997; Patel et al., 2005).Мутационныйанализподтвердил,чтоТФMox1иMox2являютсянеотъемлемыми компонентами генетической сети сомитогенеза.

У мышей с нулевоймутацией Mox2 не развиваются отдельные виды мышц, снижена общая мышечнаямасса, но не страдает развитие скелета (Mankoo et al., 1999). Напротив, при мутации поMox1 миогенез остается малоизмененным, но нарушается формирование осевогоскелета, особенно ростральной его части: наблюдаются дефекты строения затылочныхкостей, краниовертебрального сочленения, позвонков и ребер (Skuntz et al., 2009). Каквыяснили совсем недавно, у людей именно мутации по Mox1 в гомозиготном42состоянииведуткмножественныманомалиямразвитияшейногоотделапозвоночника, известным как синдром Клиппеля–Фейля аутосомно-рецессивногоподтипа (Bayrakli et al., 2013; Mohamed et al., 2013). В сравнении с эффектом двойноймутации Mox1/Mox2 эти данные говорят о том, что у млекопитающих функция Mox2 всклеротоме, но не миотоме, может быть компенсирована за счет Mox1, и наоборот,Mox1 заменим в развитии миотомов, но не склеротомов.Дальнейшие исследования показали, что двойная нулевая мутация Mox1/Mox2приводит к катастрофическим последствиям в развитии сомитов: нарушается ихэпителизация и правильное рострокаудальное распределение, не поддерживаютсяграницы соседних сомитов (Mankoo et al., 2003).

Страдает дифференциация клеток каксклеротома, так и дермомиотома. Осевой скелет и большинство скелетных мышц неформируется:уноворожденныхмышатдорсомедиальнорасположеныдвамонолитных хряща, соответствующие нейральным дугам позвонков по положению;тела позвонков, ребра и тазовый пояс отсутствуют, равно как и мышцы шеи, спины,живота, конечностей и бурый жир. Нарушение сомитогенеза проявляется вобразовании мезодермальных метамеров неправильной формы, вокруг которых ненаблюдается базальной мембраны. На более поздних стадиях не происходитморфологической дифференциации сомита на склеротом и дермомиотом; на местеправильного периодического паттерна из клеток склеротома передней и задней долисоседних сомитов (которые в норме дают зачаток одного позвонка) находитсяоднородная нерасчлененная мезенхима.У мутантов Mox1/Mox2 в пресомитной мезодерме (сегментационной пластинке)не нарушается локализация компонентов Delta/Notch сигналинга, ответственных заработу “сегментационных часов”, что соответствует морфологически выявляемойметамеризации параксиальной мезодермы.

Однако в сформированных сомитах утаких мышиных эмбрионов нарушается нормальный паттерн экспрессии Paraxis, Dll1 иEpha4, что свидетельствует о разрушении переднезадней полярности сомитов. Почтиполное подавление экспрессии Pax1, Twist в отсутствие обоих Mox и в меньшейстепени влияние на экспрессию Pax9, Foxc2 говорит о запуске молекулярнойспецификациисклеротомов,ноглубочайшейнеисправностипрограммыихдифференцировки. Также коренным образом нарушается генетическая регуляторнаясеть развития дермомиотомов: вследствие мутации исчезает экспрессия миогенных43факторов Pax1, Pax3, сильно подавляется экспрессия Myf5, Myogenin (Mankoo et al.,2003).В целом, данные мутационного анализа дают основания считать ТФ Moxпозвоночных важнейшими регуляторами развития мезодермы, ее морфогенеза,паттернирования и дифференцировки.