Диссертация (Иммуноморфологические ассоциации инфекции helicobacter pylori с показателями воспаления и дисфункции эндотелия в оценке течения и прогноза ишемической болезни сердца), страница 12

По завершению анализа, назубце с положительным контролем должны быть две серо-голубые точки. На зубце с отрицательным контролем должна появиться верхняя точка, а нижней точкилибо вовсе не должно быть, либо она должна быть слабой. Верхняя точка такжедолжна появиться на всех остальных зубцах, подтверждая, что образец был добавлен. Анализировалась центрифугированная надосадочная жидкость сыворотки, либо плазмы крови. Уровень анти-Н. pylori IgG в каждом из образцов оценивался, сравнивая интенсивность окраски нижней точки каждого зубца с цветовойшкалой CombScale, входящей в состав набора. Величины равные, либо большие20 U/ml указывают на инфицирование Н. pylori.Количественное определение уровня С-реактивного белка сыворотки кровипроводили с использованием набора реагентов «CRP Latex L» фирмы «HospitexDiagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя.

Использовалась свежая сыворотка без гемолиза комнатной температуры. Условия измерения: длинаволны 546 ± 20 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.Расчёт определяли по формуле:(А2 – А1)пробыХ концентрация калибратора(А2 – А1)калибратораМетод линеен до концентрации 150 мг/л. Образцы с более высокой концентрациC-RP, мг/л =ей необходимо развести физиологическим раствором в 1/5 и повторить измерение, полученный результат умножить на 5. Детекционный предел: 1 мг/л.Количественное определение гомоцистеина проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Axis-Shield» (Норвегия) согласно инструк-60ции производителя. Данная тест-система предназначена для определения гомоцистеина в сыворотке или плазме крови методом иммуноферментного анализа.

Свежесобранные образцы плазмы или сыворотки должны быть центрифугированысразу после забора крови. В проведённом исследовании была использована ЭДТА-плазма или сыворотка крови по предписанной методике производителя. Образец цельной крови должен быть оставлен для образования сгустка не более чем на30 минут при комнатной температуре. У образцов крови после формирования сгустка отделяли сыворотку или хранили этот образец на льду до отделения сыворотки. ЭДТА-образцы центрифугируются или помещаются на лёд немедленно после получения. Образцы плазмы могут храниться на льду до 6 часов после центрифугирования и отделения.

Перед началом анализа все реагенты должны достичь комнатной температуры (18-26°С). Считывание оптической плотности ячеекпроводилось при 450 нм в течение 15 минут с использованием автоматическоговстряхивания. Референс-значения гомоцистеина были установлены с доверительным интервалом 95% - 5-15 мкмоль/л, калибраторы имеют концентрацию в диапазоне от 2,0 до 50,0 мкмоль/л. Чувствительность была определена с использованием разведенных SAH-калибраторов с концентрациями от 4,0 до 0,5 мкмоль/л.Полученная чувствительность данного метода – 1,0 мкмоль/л с CV (коэффициентом вариации) < 20%.Количественное определение sP-селектина проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия) согласно инструкции производителя. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450нм, прямо пропорциональна концентрации sP-селектина, присутствующего в образцах.

Концентрация sP-селектина в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по приготовленным разведениям стандарта sP-селектина. Дляанализа используется сыворотка или плазма крови. Отделение сыворотки от сгустка эритроцитов проводится сразу после свёртывания крови. Субстратный раствор должен иметь комнатную температуру перед использованием. Определениеоптической плотности ячеек при 450 нм против «Бланка», желательно использо-61вать длину волны сравнения 620 нм (допустима длина волны сравнения в диапазоне 610-650 нм) с расчётом среднего значения поглощения для каждого стандарта и образца.Количественное определение молекулы сосудистой адгезии (sVCAM-1) проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «BenderMedSystems» (Австрия) согласно инструкции производителя. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрацииsVCAM-1, присутствующего в образцах.

Концентрация sVCAM-1 в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по 5 разведениям стандартаsVCAM-1. Для исследования использовалась сыворотка крови, отделённая от сгустков эритроцитов сразу после свёртывания крови. Субстратный раствор должениметь комнатную температуру перед использованием. Определение оптическойплотности ячеек при 450 нм против «Бланка», желательно использовать длинуволны сравнения 610-650 нм с расчётом среднего значения поглощения для каждого стандарта и образца.

Минимально определяемая концентрация sVCAM-1,измеренная как среднее плюс 3 стандартных отклонения 6-кратно измеренногообразца 0 нг/мл (разводящий раствор) составляет 0,6 нг/мл.Количественное определение молекулы межклеточной адгезии (sICAM-1)проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «BenderMedSystems» (Австрия) согласно инструкции производителя. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрацииsICAM-1, присутствующего в образцах. Концентрация sICAM-1 в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по 5 разведениям стандартаsICAM-1.

Для исследования использовалась сыворотка крови, отделённая от сгустков эритроцитов сразу после свёртывания крови. Субстратный раствор должениметь комнатную температуру перед использованием. Определение оптическойплотности ячеек при 450 нм против «Бланка», желательно использовать длинуволны сравнения 610-650 нм с расчётом среднего значения поглощения для каждого стандарта и образца. Минимально определяемая концентрация sICAM-1, из-62меренная как среднее плюс 3 стандартных отклонения 10-кратно измеренного образца 0 нг/мл (разводящий раствор) и составляет 2,2 нг/мл.ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ1. Существование связи между ИБС и гастродуоденальной патологией прифиброэзофагогастродуоденоскопии позволяет выявлять разнообразную патологию, обусловленную хроническим воспалительно-деструктивным процессом слизистой оболочки желудка и ДПК, наиболее характерную для больных с ОКС.2.

Проведение морфологического исследования биоптатов и сравнительногоанализа результатов гистологического метода позволяют определить наличие связи между прогрессированием инфекции H. pylori и развитием ИБС, а так же зависимости течения ИБС от выраженности H.

pylori-ассоциированного воспаления.3. Прогрессирование хеликобактериоза вне зависимости от наличия соматической патологии и заболеваний сердечно-сосудистой системы характеризуетсяналичием инициированного инфекцией H. pylori хронического воспалительногопроцесса в системном кровотоке, проявляющегося иммунологическим дисбалансом и атерогенными нарушениями липидного обмена.4. У больных ИБС в периферической крови выявляются признаки хронического инфекционного воспалительного процесса с несостоятельностью иммунологической защиты и атерогенными изменениями липидного обмена, этиологически обусловленного инфекцией H.

pylori. Прогрессирование хеликобактериоза поплощади и степени обсеменения H. pylori слизистой оболочки желудка и ДПК убольных ИБС ассоциируется с прогрессированием системного атерогенного воспалительного процесса.5. Прогрессирование H. pylori-ассоциированного хронического активноговоспаления слизистой оболочки во всех отделах желудка и ДПК у больных ИБСиндуцирует иммуновоспалительную дисфункцию эндотелия сосудов системногокровотока с активацией эндотелиоцитов и разбалансировкой механизмов межклеточного взаимодействия.636. Развитие неблагоприятных исходов у больных ИБС после выписки из стационара наблюдается чаще при большей выраженности прогрессирующего, возрастающего H.

pylori–ассоциированного хронического активного воспаления.7. Проведение эрадикационной терапии H. pylori у больных ИБС с прогрессирующим хеликобактериозом способствует стабилизации течения ИБС с предотвращением развития повторных коронарных событий.СТЕПЕНЬ ДОСТОВЕРНОСТИ И АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВРабота выполнена в Федеральном государственном бюджетном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военномедицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны РоссийскойФедерации на кафедре микробиологии, заведующий профессор Сбойчаков Виктор Борисович.Набор больных в группы наблюдения проводился в отделении реанимации иинтенсивной терапии, кардиологическом и терапевтическом отделениях НУЗ«Дорожная клиническая больница на станции Ярославль ОАО «РЖД» (директор –доктор медицинских наук М.С.

Могутов). Специальные методы иммунологического исследования в крови уровней маркеров эндотелиальной дисфункции сосудов проведены в иммунологической лаборатории ГБУЗ ЯО «Ярославская областная клиническая больница» (главный врач – Заслуженный врач РФ, кандидат медицинских наук О.П. Белокопытов).При проведении лабораторных методов диагностики применялся принципдвойного слепого исследования.Статистическая обработка данных проводилась с помощью статистическогопакета Statistica 8,0 (StatSoft, Inc.). Тестирование параметров распределения проводили с применением критериев Колмогорова-Смирнова, асимметрии и эксцесса. Данные исследований представлены в виде mean ± sd (среднее значение ±стандартное отклонение). Сравнение непрерывных величин с нормальным распределением проводилось с помощью парного t-теста.