Диссертация (Фитохимическое исследование клубней топинамбура и создание лечебно - профилактических средств на его основе), страница 8

Первичные амины даютпурпурную окраску, измеряемую при длине волны 570 нм, а вторичные(пролин и оксипролин) образуют соединения желтой окраски, измерениекоторых проводили при длине волны 440 нм.2.2.2. Анализ углеводного составаКачественное определение свободных сахаров проводили в очищенномводном извлечении, используя реакцию Бертрана.

Связанные сахара44определяли той же реакцией Бертрана после гидролиза кислотой сернойразведенной на кипящей водяной бане.Присутствие углеводов было доказано с помощью хроматографии втонком слое сорбента. Анализ проводили на пластинках «Сорбфил- ПТСХАФ-А-УФ» в системе растворителей: изопропанол-вода (4:1). В качестведетектирующих реагентов использовали: антроновый реактив, резорциновыйреактив и дифениламиновый реактив.Длякачественногоиколичественногоопределениясвободныхуглеводов использовали метод прямофазной ВЭЖХ при следующихусловиях: колонка Luna 100 - 5 NH2 4,6 х 250 mm (5 мм) или аналогичная сподвижной фазой: ацетонитрил - вода (70:30) при скорости потока 1 мл/мин,при комнатной температуре с рефрактометрической детекцией. Для анализасвязанных углеводов водное извлечение гидролизовали 1 М растворахлористоводородной кислоты при 100 0С в течение 2,5 часов.

Содержаниесвязанных углеводов определяли методом капиллярного электрофореза,используя прибор Applied Biosistem 273Т. Обработку электрофореграммосуществляли с помощью той же программы, что и свободных сахаров.Отношение пиков и расчет концентраций проводили по внутреннему(глюкозамин) и внешнему (смеси 5 анализируемых углеводов) стандарту вконцентрации 1 г/л.2.2.3. Качественный и количественный анализ аскорбиновойкислотыАнализаскорбиновойкислотыосуществлялиметодомВЭЖХ.Использовали хроматограф высокого давления, укомплектованный системойградиатной подачи элюента.

[80]. УФ -диоднометричний детектор скомпьютерной системой сбора и обработки результатов, функционирующийпри следующих условиях: - колонка 250×4,6 мм, сорбент Kromosil 100–5С18 сразмером частиц 5 мкм температура термостата 380С длина волныдетектирования 280 нм; подвижная фаза: ацетонитрил, 0,01% раствор45фосфорнойкислоты-градиентныйрежимэлюирования,скоростьэлюирования 1мл/мин.

В качестве стандарта использована аскорбиноваякислота фирмы (Sigma A-5960).2.2.4. Определение сапониновИдентификацию сапонинов в клубнях топинамбура проводили методомТСХ по методике Британской фармакопее [152]. Анализ проводили напластинках «Сорбфил- ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе растворителей: нбутанол кислота уксусная – ледяная вода (5:1:4); проявитель 10% растворкислоты серной в 40% этаноле.Для количественного определения сапонинов был выбран хроматоспектрофотометрический метод, в основе которого использовано свойствосапонинов давать окрашивание при взаимодействие с кислотой сернойконцентрированной. В качестве стандарта использовали эсцин фирмы Fluka [106].2.2.5.

Определение инулина и фруктозидов и фруктозановДляидентификацииинулинапредложенметодтонкослойнойхроматографии, описанный Шматковым Д.А. [142]. Анализ проведенпластинках«Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ»всистемерастворителе:изопропанол-вода (4:1). Проявитель: 20% спиртовый раствор тимола икислота серная разведенная.Количественное определение фруктозанов и фуктозидов проводилиспектрофотометрическим методом по реакции фруктозидов и фруктозанов соспиртовым раствором резорцина, стандартом служил инулин (Sigma 12255)[142].Эти методики явились основой для количественного определенияполисахаридов (фруктозанов и фуктозидов) в сырье, извлечениях, сухомэкстракте, а также содержимое капсулы и настойки гомеопатическойматричной.46Определение суммарного содержания полисахаридов в пересчете наинулин, проводили на спектрофотометре «Cary 50» (λ=483±2 нм), в кювете столщиной слоя 10 мм, в качестве раствора сравнения использовали воду, вкачестве стандарта использовали инулин (Sigma 12255).1.

Определение суммы полисахаридов в сухом сырьеМетодика. Аналитическую пробу высушенных клубней топинамбураизмельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиямидиаметром 2 мм. Аналитическую пробу свежих клубней топинамбураизмельчали ножом до размера частиц, не более 5 мм. Около 1 г (точнаянавеска) измельченного высушенного сырья или 5 г (точная навеска свежегосырье) помещали в коническую колбу вместимостью 300 мл, прибавляли 60мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, охлаждалипри комнатной температуре в течение 5 мин.

Полученное извлечениефильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл, такимобразом, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. Шрот в коническойколбе промывали 10 мл воды и фильтровали в ту же мерную колбу.Экстракцию повторяли еще дважды, приливая к шроту каждый раз по 30мл воды очищенной и нагревая в течение 15 мин. По окончании процедуры,переносили шрот на ватный фильтр, и промывали коническую колбу дважды,используя каждый раз 10 мл воды очищенной, а затем промывали осадок нафильтре, используя каждый раз по 10 мл воды. Отжимали вату со шротом.К полученному извлечению прибавляли 2 мл 10% раствора свинцаацетата, перемешивали и оставляли на 10 мин затем прибавляли 2 мл 5%раствора натрия фосфата, перемешивали, оставляли на 5 мин.

Доводилиобъем раствора в колбе водой до метки, перемешивали (раствор А).Раствор А фильтровали через фильтровальную лабораторную марки"Ф", отбрасывая первые 10 – 15 мл фильтрата. После чего 5 мл фильтрата изклубней топинамбура помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл,доводили объем раствора в колбе водой до метки, перемешивали (раствор Б).47В две конические колбы вместимостью 50 мл отмеривали по 5 мл 0,1%спиртового раствора резорцина и по 10 мл 30% раствора кислотыхлористоводородной. В первую колбу отмеривали 5 мл раствора Б(анализируемый раствор), во вторую 5 мл воды (раствор сравнения). Обеконические колбы нагревали до 80 0С в течение 20 мин, охлаждали докомнатной температуры. Содержимое колб количественно переносили вмерные колбы вместимостью 25 мл, доводили объем раствора в колбах 30%раствором кислоты хлористоводородной до метки, перемешивали.Оптическую плотность анализируемого раствора измеряли с помощьюспектрофотометра при длине волны 483 нм относительно растворасравнения, в кювете с толщиной слоя 10 мм.Содержание суммы фруктозанов и фруктозидов в пересчете на инулин иабсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле:Х D  200  100  25  100D  2000000;498  m  5  5  100  W  498  m  a  100  W D – оптическая плотность испытуемого раствора;498–удельныйпоказательпоглощенияпродуктовреакциивзаимодействия инулина с резорцином в кислой среде;m – масса сырья в граммах;а – количество миллилитров извлечения, взятое на анализ;W –потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.2.Количественноеопределениеполисахаридов(фруктозановифруктозидов), в извлечениях клубней топинамбура.10 мл полученного извлечения помещали в мерную колбу вместимостью200 мл, добавляли 150 мл воды очищенной.

К полученному извлечениюприбавляли 2 мл 10% раствора свинца ацетата, перемешивали и оставляли на10 минут, затем прибавляли 2 мл 5% раствора натрия фосфата,перемешивали, оставляли на 5 мин, доводили объем раствора в колбе водойдо метки, перемешивали (раствор А).Далее поступали, как описано выше («Определение суммы полисахаридов всухом сырье»).48Содержание суммы фруктозанов и фруктозидов в извлечениях впересчете на инулин в процентах (Х) вычисляли по формуле:Х D  200  100  25D  20000; где498  a  5  5498  aD – оптическая плотность испытуемого раствора;–498удельныйпоказательпоглощенияпродуктовреакциивзаимодействия инулина с резорцином в кислой среде;а – количество извлечения, взятое на анализ (мл).3. Определение суммы полисахаридов в сухом экстракте.Около 0,1 г (точная навеска) сухого экстракта помещали в мерную колбувместимостью 100 мл, заливали 75 мл воды и перемешивали.

К полученномуизвлечению прибавляли 2 мл 10% раствора свинца ацетата, перемешивали иоставляли на 10 минут, затем прибавляли 2 мл 5% раствора натрия фосфата,перемешивали, оставляли на 5 мин, доводили объем раствора в колбе водойдо метки, перемешивали (раствор А).Раствор А фильтровали через бумажный складчатый фильтр, отбрасываяпервые 10 – 15 мл фильтрата.

После чего 10 мл фильтрата помещали вмерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора в колбе водойдо метки, перемешивали (раствор Б). Далее поступали, как описано выше(«Определение суммы полисахаридов в сухом сырье»),Содержание суммы фруктозанов и фруктозидов в сухом экстракте или вгрануляте в процентах при пересчете на инулин и абсолютно сухой экстракт(Х) вычисляли по формуле:Х D  100  100  25  100D  500000; где498  m  10  5  100  W  498  m  100  W D – оптическая плотность испытуемого раствора;498–удельныйпоказательпоглощенияпродуктоввзаимодействия инулина с резорцином в кислой среде;m – масса сухого экстракта (г);W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.4.