Диссертация (Разработка и исследование комбинированного лекарственного препарата для повышения работоспособности на основе родиолы розовой), страница 12

В результате исследований былодоказано,чтотипESIимеетчувствительностьиселективность,удовлетворяющую целям нашего исследования, чем APCI или смешанный тип,поэтому был выбран ESI тип ионизации (таблица 3.7).Таблица 3.7 Сравнительная характеристика типов ионизации по параметру S/NТипESIAPCIDUIS (ESI + APCI)ионизации/параметрS/N10,18,78,9763.3.4 Масс-спектрометрические параметрыТип ионизации – ESI, полярность – позитивная для витаминов А, В1, В2,В6, D3 и негативная для витаминов С и К, напряжение на капилляре – 3000 В,давление распылительного газа – 2,0 - 5,5 атм., температура камеры – 350 °С;режим детектирования – SIM (Single Ion Mode); значения m\z, показавшихнаивысшую селективность определения изучаемых веществ, приведены длякаждого витамина в таблице 3.8.Таблица 3.8 – Величина m/z для исследуемых витаминовВитаминm/zВитамин А537,30Витамин В1381,20; 381,30Витамин В2353,20Витамин В6168,10Витамин С175,00Витамин D3391,20Витамин К450,30; 450,40Отдельные хроматографические параметры для каждого витамина приведены вглаве 2.3.4.6.3.3.5 Количественное определениеДля количественного определения использовался метод внешнегостандарта.

Для этого готовили стандартные растворы витаминов (см. раздел2.3.4.6.). Концентрация витаминов(мкг/мл) в испытуемом растворерассчитывалась по формуле:,где(2)– концентрация стандартного раствора (мкг/мл),пика определяемого вещества в испытуемом растворе,определяемого вещества в стандартном растворе.- площадь– площадь пика77Расчет количественного содержания витаминов в ЛРС столбиков срыльцами кукурузы проводят по формуле:,где(3)– концентрация витамина в испытуемом растворе, мкг/мл; V – объемиспытуемого раствора, мл; m навески – масса навески для приготовленияиспытуемого раствора, мкг.3.3.6 Определение витаминов в ЛРС и СЭ столбиков с рыльцами кукурузыОпределение витаминов в измельченном сырье столбики с рыльцамикукурузы и сухом экстракте проводили на приборе «Agilent 1200» методомВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором с программным обеспечениемChemStation vB.03.01-SR1.

Для расчета количества витаминов использовалсяметод внешнего стандарта. Пики по времени удерживания стандартныхрастворов соответствовали растворам ЛРС и СЭ. Хроматограммы стандартногои исследуемого растворов приведены в приложении 4.78Выводы к главе 3:1.Разработана методика, позволяющая проводить как качественный, так иколичественный анализ корневищ и корней родиолы розовой методомградиентной ВЭЖХ по содержанию в них рутина, розарина, розина,салидрозида, тирозола, аскорбиновой кислоты, кверцетина и хлорогеновойкислоты, а также плодов шиповника собачьего по содержанию аскорбиновойкислоты, кверцетина и хлорогеновой кислоты ВЭЖХ методом.2.Предложена стандартизация готовой ЛФ по двум основным БАВ –салидрозиду и аскорбиновой кислоте.

Проведена валидация методики ВЭЖХ попоказателям: линейность, специфичность, правильность, прецизионность,предел количественного определения.3.РазработанаметодикаВЭЖХ/МС,позволяющаяпроводитькаккачественный, так и количественный анализ витаминов (А, В1, В2, B6, D3, K) вЛРС и СЭ столбиков с рыльцами кукурузы.79ГЛАВА4.РАЗРАБОТКАТЕХНОЛОГИИПОЛУЧЕНИЯСУХИХЭКСТРАКТОВ РОДИОЛЫ РОЗОВОЙ, ШИПОВНИКА СОБАЧЬЕГО ИСТОЛБИКОВ С РЫЛЬЦАМИ КУКУРУЗЫПри разработке технологии получения ЛП методы экстракции ЛРСнаправлены на максимально возможное извлечение действующих веществ.4.1. Получение сухого экстракта родиолы розовой и оценка его качестваВисследованиииспользованосырьёфирмыОАО«Красногорсклексредства»».

Определяли качество сырья по показателям и методикам,описанным в ФС (ЛСР-008315/08-211008). Определяли содержание основногодействующего вещества - салидрозида по методике, описанной в главах 2 и 3.Результаты исследования представлены в таблице 4.1.Таблица 4.1 - Числовые показатели растительного сырья «Корневища и корниродиолы розовой»№ п/пПоказательСодержание, %1.Салидрозид1,36±0,042.Влажность6,3±0,23.Зола общая7,53±0,026.Частицы, не проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7мм7.Частицы, проходящие сквозь сито с отверстиями размером 0,5мм4,7±0,10,5±0,28.Органическая примесь0,6±0,39.Минеральная примесь0,4±0,1Согласно полученным результатам, лекарственное растительное сырьёкорневища и корни родиолы розовой соответствует требованиям ГФ РФФС.2.5.0036.15 по всем изученным показателям.С целью получения сухого экстракта на первом эпапе исследованияполучали извлечение из ЛРС родиолы розовой.

Использовали наиболеераспространенный и эффективный метод экстракции - метод противоточногомногоступенчатого экстрагирования в батарее из 5-х диффузоров [139]. Поданным литературы, при этом способе экстрагирования достигается максимально80возможный выход действующих веществ, а энергетические затраты, при этомоказываются минимальными [69, 103, 128].Экстрагентом служил 40 % спирт этиловый, соотношение сырье: готовыйпродукт составляет 1:1, сырьё измельчали до 2 – 5 мм на дисковой мельнице [101,102]. Выбор метода экстракции и экстрагента основан на литературных данных итехнологии выпускаемого промышленностью жидкого экстракта родиолы розовой(ФС 42-2163-96 Экстракт родиолы розовой).Общий объем экстрагента, с учетом коэффициента поглощения, составлял1055 мл.

Экстрагирование вели в батарее из 5-х экстракторов (перколяторов). Впервый засыпали 50 г измельчённых до 2 - 5 мм и просеянных корневищ и корнейродиолы розовой. Сырьё утрамбовывали и заливали 40 % спиртом в соотношении1:1 с учётом коэффициента поглощения (Кп=1,6 мл/г) до «зеркала». Объёмэкстрагента составлял 580 мл. Время настаивания – 24 ч. На второй день во 2-ойдиффузор загружали 50 г измельчённого сырья и переносили извлечение изпервого экстрактора во второй в количестве до «зеркала». Первый заливали 580 млэкстрагента - спирта этилового 40 %. Оставляли на 24 ч.

По аналогии свышеперечисленным, загружали перколяторы 3 и 4. На пятый день в 5-йэкстрактор вносили 50 г измельчённого сырья и заливали его извлечением из 4-гоперколятора, перемещая вытяжки из 4-го перколятора в 5-й перколятор, из 3-гоперколятора в 4-й перколятор, из 2-го перколятора в 3-й перколятор, из 1-гоперколятора во 2-й перколятор. Первый экстрактор отключали, рекуперировалиспирт этиловый, поглощенный сырьем, отработанный шрот помещали в отходы.Во 2-й экстрактор с максимально истощённым сырьём заливали чистыйэкстрагент.На 6-й день из 5-го перколятора сливали 50 мл экстракта родиолы розовойи фильтровали через фильтровальную бумагу марки Ф.

В последующие дниосуществляли передвижение извлечения аналогично вышеописанной схеме,при этом из «головного» (5-го по счету) перколятора сливали готовый продукт ифильтровали его, а из «хвостового» рекуперировали спирт этиловый и удалялишрот.81экстракт12345ЭкстрагентРисунок 4.1 - Схема получения извлечения из корневищ и корнеейродиолы розовой методом противоточного многоступенчатого экстрагированияв батарее из 5-х диффузоров.Проводили определение содержания основных биологически активныхвеществ в полученном извлечении: органических кислот, флавоноидов,полисахаридов, а также соединений группы фенольных гликозидов, проводилиметодом ВЭЖХ, в соответствии с методикой, описанной в 3-й главе (3.1.).Результаты определения представлены в таблице 4.2.Таблица 4.2 - Содержание основных биологически-активных веществ в жидкомэкстракте родиолы розовойНаименование соединенияЧисловой показатель полученного экстрактаАскорбиновая кислота, мкг/млне обнаруженаХлорогеновая кислота, мкг/мл0,0061±0,0002Кверцетин, мкг/мг1,43±0,12Рутин, мкг/мг0,83±0,3Розавин мкг/мг0,2±0,01Розарин мкг/мг0,51±0,02Розин мкг/мг0,17±0,01Салидрозид мкг/мг3,14±0,17Тирозол мкг/мг1,31±0,0582Полученное спиртовое извлечение из корневищ и корней родиолырозовой отстаивали в течение суток при температуре 2-8 °С.

Затем экстрактфильтровали через фильтровальную бумагу марки Ф и упаривали с помощьюваккум-выпарного аппарата (BUCHI, Швейцария) сначала при давлении175 мБар, температуре бани 60 °С и скорости вращения колбы 120-140 об/мин, азатем, после отгона этанола при 72 мБар для сгущения водной фракции с цельюуменьшения объёма жидкости.Полученное сгущённое извлечение помещали в морозильную камеру стемпературой − 25 °С на 6-8 часов и затем высушивали в сублимационнойсушилке HetoDrywinner CT/DW 60E с вакуумно-роторным насосом RZ 2(Vacuubrand, Германия) при давлении 0,010 мБар и температуре 21 °С, в течениине менее 18 часов.Идентификацию и количественное определение действующих веществ всухом экстракте родиолы розовой проводили методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии, по методике, описанной в 3-й главе, разделе 3.1.Результаты анализа представлены в таблице 4.3.Таблица 4.3 – Результаты анализа сухого экстракта родиолы розовойПоказательХлорогеновая кислотаРезультат полученного экстракта, мкг/мг0,052±0,0026Кверцетин12,05±1,2Рутин6,96±0,35Розавин1,69±0,1Розарин4,35±0,2Розин1,49±0,1Салидрозид26,47±1,4Тирозол11,08±0,5Данные, приведённые в таблице 4.3, свидетельствуют, что сухой экстрактиз корневищ и корней родиолы содержит идентичный с ЛРС комплексбиологически активных веществ.83Кроме того, проводили изучение показателей качества сухого экстрактародиолы розовой по ГФ РФ ОФС1.4.1.0021.15 «Экстракты».Таблица 4.4 – Результаты изучения показателей качества сухого экстрактародиолы розовойПоказательНормыМетод определенияСоостветствиеГФ РФОписаниеНасыпная плотностьТяжелые металлыПотеря в массе привысушиваниипорошок оранжево- визуальнокоричневого цвета схарактернымзапахомГФ РФ,ОФС.1.4.2.0016.150,53±0,30 г/млСтепень сыпучестипорошковГФ РФ,0,002±0,0005 %ОФС.1.4.2.0016.15ГФ РФ4,7±0,2 %ОФС.1.2.1.0010.15Соотв.Не более 0,6 г/млНе более 0,01%Соотв.Технологическая схема получения сухого экстракта из корневищ и корнейродиолы розовой представлена на рисунке (Рис.

4.1)Полученный сухой экстракт родиолы розовой упаковывали в тару изтёмного стекла по 50,0 г., укупоривали навинчивающейся крышкой и длягерметичности и обрабатывали расплавленным парафином. Хранили впрохладном, защищённом от света месте.84ВР.1.1Подготовка водыочищеннойВР.2.1ПодготовкасырьяВР.2.2ПодготовкаперсоналаВР.2.3ПодготовкаоборудованияВР.3.1ИзмельчениесырьяВР.3.2ПросеиваниесырьяТП.4.1Подготовкаспиртаэтилового 40 %ТП.4.2ЭкстрагированиесырьяТП.4.3Очистка ифильтрованиеизвлеченияТП.4.4КонцентрированиеизвлеченияТП.5.1СушкаизвлеченияВР.1ВР.2Кт, КмВР.3Кт, КхТП.4Кт, КхТП.5Кт, КхУМО.6Кт, КхТП.6Подготовка водыПодготовкапроизводстваПодготовкасырьяПотериПолучениежидкого экстрактаПолучениесухого экстрактаОтходыУпаковка в таруиз тёмногостеклаПотериХранение взащищенном отсвета местеРисунок 4.2 - Технологическая схема получения сухого экстракта изкорневищ и корней родиолы розовой854.2Получение сухого экстракта из плодов шиповника собачьего, иоценка его качестваПлоды шиповника были закуплены у фирмыЗАО«Фито-ЭМ»,определение числовых показателей проводили по методикам, описанным в ФС(ЛП 000111-271210) и химический состав изучали по методикам, описанным вглавах 2 и 3.