Диссертация (Разработка и исследование комбинированного лекарственного препарата для повышения работоспособности на основе родиолы розовой), страница 11

Для построения калибровочныйграфиков анализируемых веществ, последовательно вводили 5, 10, 15 и 20 мклкаждого стандартного раствора.Учитывая различные химико-физические характеристики перечисленныхсоединений,требовалосьразработатьметодикиопределения, включающие в себя следующие стадии:количественного651) подбор подвижной фазы на основе растворимости исследуемых веществ.Установлено, что рутин необходимо определять отдельно от кверцетина, т.к. онне растворяется в ПФ с ацетонитрилом. При определении аскорбиновойкислоты, кверцетина, хлорогеновой кислоты, в качестве подвижной фазыиспользовали раствор 0,1 % трифторуксусной кислоты в воде и ацетонитрил;при определении рутина, розарина, розина, салидрозида, тирозола в качествеподвижной фазы использовали раствор 0,1 % трифторуксусной кислоты в водеи метанол.2) в составе каждой группы анализировали индивидуальные соединения напредмет возможности их детектирования на УФ-детекторе.3) следующим этапом был подбор максимума поглощения (длины волны),обеспечивающего оптимальную чувствительность.Для наилучшего разделения анализируемых компонентов проводилиподбор соотношения растворителей в различные моменты времени (градиент).Подобрав условия анализа, переходили к реальным экстрактам, содержащимнаряду с анализируемыми веществами целый ряд соэкстрактивных веществ, вбольшинстве случаев, мешающих определению целевых компонентов.

На этомэтапе, изменяя условия (градиент, температура колонки, скорость потокарастворителей) добивались полного разделения компонентов сложной матрицы.Калибровка прибора проводилась по стандартам анализируемых веществи включала в себя измерение площадей пиков анализируемых веществ,соответствующих различным концентрациям (не менее четырех для каждоговещества). Далее были проанализированы точные навески реальных образцов.Данные калибровки должны были отвечать определенным параметрам(линейностьвдиапазонеанализируемыхконцентраций,сходимость–коэффициент вариации для предела количественного определения составляет20 %, для остальных – 15 %.) (табл. 3.1, 3.2).66Таблица3.1Подбороптимальныхусловийхроматографирования(скорости потока)Скорость потока, мл/минФакторассимиляции пика0,51,01,41,82,00,50,91,01,21,2512000120001800014000160000,80,71,50,71,3ЧислотеоретическихтарелокРазрешениеТаблица3.2Подбороптимальныхусловийхроматографирования(температуры колонки)Температура колонки, °СФакторассимиляции пика25303540450,51,00,71,31,315000180001200017000160001,11,50,91,10,5ЧислотеоретическихтарелокРазрешениеБыла проведена попытка проанализировать содержимое капсул наиспытуемые вещества методом градиентной ВЭЖХ, не разбивая их на группы.Определение проводили на жидкостном хроматографе фирмы Waters Breeze сУФ-детектором 2487, колонка SymetryC-18, 4.6x150 мм, 5 мкм.

Подвижнойфазой являлся метанол:0,1 % трифторуксусная кислота (рис.3.1).67Рисунок 3.1. ВЭЖХ-хроматограмма содержимого капсул СЭРШКВ результате эксперимента было выявлено, что не представляетсявозможным выявить анализируемые вещества на одной хроматограмме, т.к.аскорбиновая кислота попадает в «мёртвый объём» вместе с растворителем.Пики стандартизуемых компонентов – салидрозида и аскорбиновой кислотыблизки и при совместном определении могут накладываться друг на друга.Таким образом, была показана целесообразность раздельного количественногоопределения компонентов СЭРШК.Подготовка проб и условия хроматографирования подробно описаныранее, в главе 2.3.4.3.2 Валидация методик определения БАВВалидациялинейность,методик проводилась поправильностьипараметрам: специфичность,прецизионность,пределколичественногоопределения – согласно рекомендациям FDA и EMA, а также ГФ РФ ОФС«Валидация аналитических методик».Несмотря на то, что методики идентификации и количественногоопределения были разработаны для всех 4 групп соединений, содержащихся всмеси СЭРШК, валидацию проводили только для разработанных методик настандартизуемые БАВ для определения показателей качества готовой ЛФ –салидрозид и аскорбиновая кислота.Специфичность.

Для определения специфичности проводили анализэкстрактов (навеска 30-40 мг в 1 мл подвижной фазы В), содержащих рутин,кверцитин, аскорбиновую кислоту, хлорогеновую кислоту, розавин, розарин,68розин, салидрозид, тирозол. На полученных хроматограммах (рис.3.2-3.5)показано, что соэкстрактивные вещества не мешают определению БАВ.Рисунок 3.2 - ВЭЖХ-хроматограмма экстракта родиолы розовой, содержащегосалидрозид и тирозолРисунок 3.3 - ВЭЖХ-хроматограмма экстракта родиолы розовой, содержащегокверцетин и хлорогеновую кислоту69Рисунок3.4ВЭЖХ-хроматограмма-экстракташиповникасобачьего,экстракташиповникасобачьего,содержащего аскорбиновую кислотуРисунок3.5-ВЭЖХ-хроматограммасодержащего кверцетин и хлорогеновую кислотуЛинейность.Проводили анализ четырёх образцов стандартных растворов,определяемых БАВ.

Концентрации, калибровочный график и уравнениекалибровочной кривой представлены в таблице 3.3.70Таблица 3.3 - Значения концентраций, уравнения калибровочной кривой икалибровочный график определяемых БАВОпределяемоеКонцентрация,КоэффициентУравнениевеществомкн/млкорреляциикалибровочнойкривойАскорбиновая500,000кислота1000,000R2=0,999937Y=1,24e+(-4,07e)+006R2=0,999039Y=2,53e+006,43e+004R2=0,828422Y=7,25e+003,81e+0051500,0002000,000Салидрозид50,000100,000150,000200,000Кверцетин140,000280,000420,000560,000По полученным данными были построены калибровочные графики (Рис. 3.63.8).Рисунок 3.6 - Калибровочный график зависимости площади пика отконцентрации аскорбиновой кислоты71Рисунок 3.7 - Калибровочный график зависимости площади пика отконцентрации салидрозидаРисунок 3.8 - Калибровочный график зависимости площади пика отконцентрации кверцетинаОтклонения концентраций калибровочных растворов рассчитаны поуравнениям линейной зависимости от фактических значений и приведены втаблице 3.4.72Таблица 3.4 - Отклонения концентраций калибровочных растворов БАВ отфактических значенийНазвание образцаНомер образцаКоличествоРассчитанноеОтклонениеколичествоАскорбиноваяst_1500,000500,3993350,080st_21000,000995,861559-0,414st_31500,0001507,0788760,472st_42000,0001996,660230-0,167st_rod50,00051,8935343,787st_rod100,00097,588615-2,411st_rod150,000149,142168-0,572st_rod200,000201,3756830,688st_qc1st_qc2st_qc3st_qc4140,000280,000420,000560,000216,405093166,307899418,168922599,11808554,575-40,604-0,4366,985кислотаСалидрозидКверцетинПолученные данные соответствуют нормам отклонений FDA и EMA (неболее 20 % для нижнего диапазона линейности, не более 15 % для остальныхточек).Правильность и прецизионность.

Анализировали по 3 образца каждоговещества в различных концентрациях. Каждый раствор хромотографировали по3 раза. Данные анализа представлены в таблице 3.5.Таблица 3.5 - Величины стандартного отклонения (SD), относительногостандартного отклонения (RSD) и относительной погрешности (ε).ВеществоВведено,мкг/млАскорбиновая 500,0кислота1000,01500,0Найдено,мкг/мл499,0496,0503,01002,01003,0995,01502,01495,01496,0СреднееSD, (n =3) RSD,значение(n=3)найденного,мкг/мл(n=3)499,333,510,7% ε, %0,131000,004,360,4301497,603,790,250,1673Продолжение таблицы 3.5Салидрозид50,0100,0150,0Кверцетин140,0280,0420,0Полученныевеличины54,046,048,099,0105,096,0154,0147,0151,0141,0135,0145,0282,0281,0283,0422,0415,0419,049,334,208,511,40100,004,604,600150,703,512,330,46140,335,033,60,24282,001,000,40,71418,703,510,830,31стандартногоотклонения(S.D),относительногостандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (ε, %)соответствуют нормам FDA и EMA (не более 20 % минимальной концентрации,не более 15 % для остальных двух концентраций).Предел количественного определения.

Предел количественного определения(ПКО) рассчитывали по формуле:,(1)где S – сигнал, N – шум.Предел количественного определения методики составил 50,0 мкг/мл длякверцитина, розавина, салидрозида, аскорбиновой кислоты.3.3 Определение витаминов в лекарственном растительном сырьекукурузы майской методом ВЭЖХ/МСДанные литературы свидетельствуют о высокой концентрации БАВ в ЛРСстолбики с рыльцами кукурузы, за счет содержания в них витаминов группы В,аскорбиновой кислоты, жирорастворимых витаминов D3, К. Вместе с тем, прианализе литературных данных было выявлено, что для определения жиро- иводорастворимых витаминов в различных объектах, широко используется методметод ВЭЖХ [56, 161].74Для определения витаминов в ЛРС и продуктах, получаемых на егооснове, был выбран метод ВЭЖХ/МС, т.к. он обеспечивает большуючувствительность методики, при примерно равных затратах, что положительносказывается на определении органических соединений в ЛРС, препаратах наоснове ЛРС.Также метод ВЭЖХ/МС обладает более высокой селективностью всравнении с градиентной ВЭЖХ.3.3.1 Разработка методики количественного определения витаминовметодом ВЭЖХ/МСДляоблегченияселективностиколичественногоопределениясодержащихся в сырье витаминов неодходимо было разработать методикиколичественного определения методом ВЭЖХ/МС, учитывающие различныефизико-химические свойства изучаемых соединений.

Ввиду своей высокойселективности,методмасс-спектрометриипозволяеткачественноиколичественно определить изучаемые вещества в смеси отдельно друг от друга,без полного хроматографического разделения веществ. Однако, для повышенияэффективности хроматографического разделения, требуется подбор подвижнойфазы, позволяющей получить хроматограмму, удовлетворяющую необходимомучислу теоретических тарелок, индивидуального компонента разделяемой смеси.3.3.2 Хроматографические условияВкачествеподвижныхфазбылиисследованы:метанол/вода,ацетонитрил/вода, метанол/0,1 % раствор HCOOH в воде, ацетонитрил/0,1 %раствор HCOOH в воде и ацетонитрил/0,2 % раствор HCOOH в воде вразличных соотношениях. Для оценки пригодности хроматографическойсистемы были использованы следующие значения: число теоретическихтарелок (ЧТТ), фактор асимметрии (Fas), коэффициент разделения (Rs) (таблица3.6).

Режим элюирования изократический, скорость элюирования – 1 мл/миндля витаминов А, В1, В2, В6, С, D3 и 0,8 для витамина К. В качественеподвижной фазы была использована колонка С18 Agilent Eclipse XDB-C18 (50× 4,6 мм, 5 мкм, США). Объем пробы, вводимой в хроматограф – 20 мкл.75Таблица 3.6 Оценка пригодности хроматографической системыСостав ПФПараметры пригодностихроматографической системыЧТТFasRsМетанол/вода24000 ± 1000,93 ± 0,012,20 ± 0,01Ацетонитрил/вода23000 ± 1000,94 ± 0,012,37 ± 0,01Метанол/0,1 % раствор HCOOH в 24500 ± 1000,97 ± 0,012,21 ± 0,01раствор 25000 ± 1001,00 ± 0,012,30 ± 0,01раствор 23000 ± 1000,92 ± 0,012,40 ± 0,01водеАцетонитрил/0,1 %HCOOH в водеАцетонитрил/0,2 %HCOOH в водеСогласно полученным результатам, наиболее высокую эффективностьхроматографии показали подвижная фаза составом ацетонитрил/0,1 % растворHCOOH в воде в соотношении 50/50 для витаминов А, В1, В2, В6, С; для такихнеполярных веществ, как D3 и K, эффективный состав подвижной фазысоставил 90/10 и 75/25, соответственно.3.3.3 Условия ионизации молекулы в масс-спектрометрииДля анализа витаминов было проверено три типа ионизации – ESI(ионизация электроспреем), APCI (химическая ионизация при атмосферномдавлении) и смешанный тип ионизации.