Диссертация (Разработка и исследование комбинированного лекарственного препарата для повышения работоспособности на основе родиолы розовой), страница 9

1.2.1.0009.15 «Оптическая микроскопия» с помощьюмикроскопа Hirox Numerique KH-7700, линза MX(G)-5040Z, разрешение 0,953мкм, увеличение х200.2.3.2.2Определение фракционного состава порошков, субстанций игранулятовОпределение фракционного состава проводили в соответствии с ГФ РФОФС.1.1.0015.15 «Ситовой анализ» путём просеивания точной навескиисследуемого вещества через стандартный набор из 4-х сит с отверстиямидиаметром 0,5; 0,3; 0,2; и 0,1 мм. Просеивание проводили на ситовоманализаторе Cisa-вибросито RP 200N в течение 5 минут. Навеску веществапомещали на верхнее сито, с самым большим диаметром отверстий. Позавершению просеивания, сита снимали.

Просеивание считали законченным,50если при дополнительном встряхивании в течение 1 минуты, количествоматериала, прошедшего через сито, составляло по массе менее 1 % материала,оставшегося на сите. Отсев каждый раз добавляли на верхнее сито. Затемопределяли массу и содержание в процентах по массе каждой фракции.2.3.2.3Определение насыпного объема порошков, субстанций игранулятовОпределение насыпного объема (относительной насыпной массы)проводили по методике, описанной в ГФ РФ ОФС.

1.4.2.0016.15 «Степеньсыпучести порошков», на тестере насыпной плотности порошков и гранулятовSVM 121, ERWEKA.2.3.2.4Определение сыпучести порошков, субстанций и гранулятовСыпучесть определяли путём пропускания определённой массы порошка(100-50 г) на тестере сыпучести GTB, фирмы ERWEKA по методике, описаннойв ГФ РФ ОФС. 1.4.2.0016.15 «Степень сыпучести порошков».2.3.2.5Определение влагосодержанияОпределение остаточной влажности проводили на весовом анализаторевлажности MB35 фирмы OHAUS по методике, описанной в ГФ РФ ОФС.1.2.1.0010.15 «Потеря в массе при высушивании».2.3.2.6Определение гигроскопичностиОпределение гигроскопичности проводили в климатической камереThermotronS (США), в течение 8 часов при температуре 20,0 ± 1,0 °С иотносительной влажности 65 ± 1,0 %. Каждый час снимали показания прибора.2.3.2.7.Определение тяжёлых металловИспытаниянатяжёлыеметаллыпроводиливсоответствиистребованиями ГФ РФ ОФС.

1.2.2.2.0012.15 «Тяжелые металлы». Сухиеэкстракты корневищ и корней родиолы розовой, плодов шиповника, столбиков срыльцами кукурузы должны содержать не более 0,01 %.2.3.3 Определение показателей качества готовой лекарственной формы –твердых желатиновых капсул с комбинацией сухих экстрактовСогласно требованиям, описанным вГФ РФ ОФС. 1.4.1.005.1551«Капсулы», готовую ЛФ стандартизовали по следующим показателям:однородность массы, однородность дозирования, распадаемость, растворение.2.3.3.1Однородность массыОпределяли по методике, описанной в ГФ РФ ОФС. 1.4.2.009.15«Однородность массы дозированных лекарственных форм».2.3.3.2Однородность дозированияИспытание проводили согласно требованиям, описанным в ГФ РФ ОФС.1.4.2.008.15 «Однородность дозирования» по способу 2 – точным определениеммассы нетто отобранной для испытания единицы препарата.2.3.3.3Распадаемость капсулПроводили по методике ГФ РФ ОФС 1.4.2.0013.15 «Распадаемостьтаблеток и капсул» на приборе «Качающаяся корзинка» ERWEKA CZ2 21 всреде 0,1 М хлористоводородной кислоты, объем среды 800 мл, как указано вГФ РФ ОФС.

1.4.1.005.15 «Капсулы».2.3.3.4Растворение капсулРастворение капсул определяли по методике, описанной в ГФ РФ ОФС.1.4.2.0014.15 «Растворение для твердых дозированных лекарственных форм» натестере растворения ERWEKA DT600 на приборе «Лопастная мешалка»(скорость вращения 50 об/мин) в среде 0,1 М хлористоводородной кислоты втечение 45 минут.

Объем среды растворения – 800 мл, температура 37±2 ˚С.Отбор проб проводили через 45 минут после начала испытания. В пробах сиспользованиемразработанныхметодикколичественногоопределенияметодом ВЭЖХ определяли содержания салидрозида.2.3.3.5Микробиологическая чистота капсулОпределение микробиологической чистоты проводили в соответствии стребованиями ГФ РФ ОФС.1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота» пообщему числу аэробных микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов,энтеробактерий, отсутствию E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus.2.3.3.6Срок годности капсулОпределение срока годности полученных твёрдых желатиновых капсул52проводили в соответствии с требованиями ГФ РФ ОФС.1.1.0009.15 «Срокигодности лекарственных средств» путём заложения 5 серий капсул на хранениепри температуре 18-22 °С и влажности воздуха 64±2 %. Срок наблюдениясоставил 24 месяца.2.3.4 Методики количественного определения БАВ в составе ЛРС, сухихэкстрактов и гранулятов2.3.4.1Подготовка проб для хроматографического анализа2.3.4.1.1.

ЛРСТочную навеску измельчённого ЛРС (10,00 мг) помещали в мерную колбувместимостью 25 мл, прибавляли воду очищенную до метки и тщательноперемешивали. Полученный раствор перемещали в пластиковые виалы ипомещали в автосемплер хроматографа.2.3.4.1.2. Сухой экстрактОтбиралиточнуюнавескуанализируемогообразца(30-40 мг)иприбавляли к ней 1 мл подвижной фазы B. Давали настояться в течении 5 минутпри температуре 50 °С.

Полученный раствор центрифугировали в течение 3минут при 3000 об/мин. Затем фильтровали через фильтр с размером пор0,45 мкм. Фильтрат переносили в емкость для хроматографирования ихроматографировали при указанных ниже условиях.Количественное определение анализируемых веществ осуществлялиметодом калибровочной кривой, построенной с использованием данныхстандартного раствора.2.3.4.1.3. ГранулятОтбирали точную навеску гранулята, содержащего СЭРШК 1:1:1 (3040 мг) и прибавляли к ней 1 мл подвижной фазы B. Давали настояться в течении5 минут при температуре 50 °С.

Полученный раствор центрифугировали втечение 3 минут при 3000 об/мин. Затем фильтровали через фильтр с размеромпор 0,45 мкм. Фильтрат переносили в емкость для хроматографирования ихроматографировали при указанных ниже условиях.Количественное определение анализируемых веществ осуществляли53методом калибровочной кривой, с использованием данных калибровокстандартного раствора.2.3.4.1.4. Твердые желатиновые капсулы (готовая ЛФ)Извлекали содержимое (точная навеска) путём вскрытия взятых дляанализа 20 капсул, помещали в ступку, перемешивали и отбирали точнуюнавеску около 375 мг, эквивалентную0,57 мг активных веществ. Навескупереносили в колбу на 50 мл и прибавляли небольшое количество 70 % этанола,взбалтывали до полного растворения и доводили объем раствора до метки темже растворителем.

Полученный раствор отфильтровывали через бумажныйфильтр (раствор А).Количественное определение анализируемых веществ осуществлялиметодом калибровочной кривой, с использованием данных калибровокстандартного раствора.2.3.4.2 Количественное определение аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХКоличественное определение аскорбиновой кислоты проводили нажидкостном хроматографе WatersBreeze с УФ-детектором 2487 при следующихусловиях:Колонка Symmetry C-18, 4.6x150 мм, 5 мкм.Подвижная фаза: А - 0,1 % раствор трифторуксусной кислоты в воде, В –ацетонитрил (HPLC grade, Chromadex).При приготовлении подвижной фазы А, в колбу вместимостью 1 лвносили около 1 л воды очищенной и прибавляли 1 мл трифторуксуснойкислоты (Sigma for HPLC).

Перемешивали. Раствор хранили в закрытой таре,срок хранения составлял один год со дня изготовления.Элюирование – градиентное, режим представлен в таблице 2.1.Таблица 2.1 - Подбор градиента концентрации при обнаружении аскорбиновойкислотыВремя (мин)0,04,06,010%А (трифторуксусная кислота в воде)10097100100%В (ацетонитрил)030054Объем пробы:10 мклСкорость потока:1 мл/минТемпература колонки:30 °СДлина волны детектора:260 нмОбъём вводимой пробы10 мклКалибровку проводили по стандарту аскорбиновой кислоты (SigmaAldrich, CAS: 50-81-7). Был приготовлен стандартный раствор с концентрациями:аскорбиновой кислоты(стандарт) 10,0мг в 10 мл воды очищенной. Дляпостроениякалибровочногографикаанализируемоговеществапоследовательно вкалывали 5, 10, 15, 20 мкл стандартного раствора.2.3.4.3 Количественное определение хлорогеновой кислоты и кверцетинаметодом ВЭЖХКоличественное определение проводили на жидкостном хроматографеWatersBreeze с УФ-детектором 2487 при следующих условиях:Колонка Symmetry C-18, 4.6x150 mm, 5 µmПодвижнаяфаза: А - 0,1 % трифторуксусная кислота в воде, В – ацетонитрил(Chromadex)Элюирование – градиентное, режим представлен в таблице 2.2.Таблица 2.2 - Подбор градиента концентрации при обнаружении хлорогеновойкислоты и кверцетинаВремя (мин)%А (0,1 % трифторуксусная кислота в воде%В (ацетонитрил)0,09734,09736,0851515802025406030973Объем вкола:10 мклПоток:1,4 мл/минТемпература колонки:30 °С55Длина волны детектора:330 нмКалибровку проводили по стандартам кверцетина (Sigma-Aldrich, CAS: 117-39-5)и хлорогеновой кислоты (Sigma-Aldrich, CAS: 327-97-9).

Были приготовленыстандартные растворы с концентрациями: хлорогеновой кислота 2,8 мг, кверцетин2,8 мг в 10 мл смеси мобильной фазы А и В (50:50). Для построения калибровочныхграфиков анализируемых веществ последовательно вкалывали 5, 10, 15, 20 мклстандартного раствора кверцетина и хлорогеновой кислоты.2.3.4.4 Количественное определение рутина методом ВЭЖХКоличественноеопределениерутинапроводилинажидкостномхроматографе WatersBreeze с УФ-детектором 2487 при следующих условиях:Колонка SymmetryC-18, 4.6x150 мм, 5 мкмПодвижнаяфаза: А - 0,1 % трифторуксусная кислота в воде, В – спиртметиловый (Chromadex).Элюирование – градиентное, режим представлен в таблице 2.3.Таблица 2.3 - Подбор градиента концентрации при обнаружении рутинаВремя (мин)%А (0,1% трифторуксусная кислота в воде)%В (спирт метиловый)0,0604015,0010020,06040Объем вкола:10 мклПоток:1 мл/минТемпература колонки:30 °СДлина волны детектора:210 нмКалибровку проводили по стандарту рутина (Chromadex, CAS: 153-18-4).