Диссертация (1141334), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Былиприготовлен стандартный раствор с концентрацией рутина 7,1 мг в 10 мл подвижнойфазы В. Для построения калибровочных графиков анализируемого веществапоследовательно вкалывали 5, 10, 15, 20 мкл стандартного раствора. Количественноеопределение анализируемого вещества осуществлялось с использованием данныхкалибровок стандартного раствора.562.3.4.5Количественноеопределениерозарина,розавина,розина,салидрозида и тирозола методом ВЭЖХКоличественное определение данных веществ в экстракте родиолыпроводили на жидкостном хроматографе WatersBreeze с УФ-детектором 2487при следующих условиях:КолонкаSymmetryC-18, 4.6x150 мм, 5 мкмПодвижная фаза: А - 0,1 % трифторуксусная кислота в воде, В – метанол(Chromadex)Элюирование – градиентное, режим представлен в таблице 2.4.Таблица 2.4 - Подбор градиента концентрации при обнаружении розарина,розавина, розина, салидрозида и тирозолаВремя (мин)%А (0,1 % трифторуксусная кислота в воде)%В (метанол)0,0703020,0406025,07030Объем вкола:10 мклПоток:1 мл/минТемпература колонки:30 °СДлина волны детектора:245, 276 нмКалибровку проводили по стандартам розина (Chromadex, CAS: 85026-55-7),розавина (Chromadex, CAS: 84954-92-7), розарина (Chromadex, CAS: 84954-93-8),салидрозида (Chromadex, CAS: 10338-51-9) и тирозола (Chromadex, CAS: 501-94-0).Были приготовлены стандартные растворы розарина, розавина, розина, салидрозида итирозола с концентрацией каждого компонента 100 мкг/мл мобильной фазы В.
Дляпостроения калибровочных графиков анализируемых веществ последовательновкалывали 5, 10, 15, 20 мкл стандартного раствора.Идентификацию всех действующих веществ проводили по относительномувремени удерживания в сравнении со стандартом, используя описанные вышехроматографические методики.572.3.4.6.
Разработка количественного определения витаминов А, В1, В2, B6, D3, Kметодом ВЭЖХ/МСДля количественного определения витаминов, содержащихся в сырье,сухом экстракте столбиков с рыльцами кукурузы, а также грануляте СЭРШКбыли приготовлены стандартные растворы: витамин А в 96 % спирте(14,35 мкг/мл), витамин В1 в воде деионизированной (11,71 мкг/мл), витамин В2в воде деионизированной (10,51 мкг/мл), витамин В6 в воде деионизированной(17,17 мкг/мл), витамин С в воде деионизированной (17,17 мкг/мл), витамин D3в 96 % спирте (14,12 мкг/мл), витамин К в метаноле HPLC grade (6,94 мкг/мл).Определение витаминов в измельченном сырье столбики с рыльцамикукурузы, сухом экстракте, грануляте проводили на приборе «Agilent 1200» смасс-спектрометрическимдетекторомспрограммнымобеспечениемChemStation B.03.01-SR1.
Для расчета количества витаминов использовалсяметод внешнего стандарта.2.3.4.6.1 Определение витамина АОбъем пробы:10 мклКолонка:Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкмПодвижная фаза:вода, подкисленная НСООН (1 мл муравьинойкислотына1лводы,рН=4,5)/ацетонитрил(50/50)Скорость потока:1,0 мл/минУсловия детектирования:SIMрежимвпозитивнойполярности,m/z=537,30; фрагментатор 1302.3.4.6.2 Определение витамина В1Объем пробы:10 мклКолонка:Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкмПодвижная фаза:вода, подкисленная НСООН (1 мл муравьинойкислоты на 1 л воды, рН = 4,5) /ацетонитрил(50/50)58Скорость потока:1,0 мл/минУсловия детектирования:SIMрежимвпозитивнойполярности,m/z=381,20; 381,30; фрагментатор 1302.3.4.6.3 Определение витамина В2Объем пробы:10 мклКолонка:Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкмПодвижная фаза:вода, подкисленная НСООН (1 мл муравьинойкислоты на 1 л воды, рН = 4,5) /ацетонитрил(50/50)Скорость потока:1,0 мл/минУсловия детектирования:SIMрежимвпозитивнойполярности,m/z=353,20; фрагментатор 1302.3.4.6.4 Определение витамина В6Объем пробы:10 мклКолонка:Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкмПодвижная фаза:вода, подкисленная НСООН (1мл муравьинойкислоты на 1 л воды, рН = 4,5) /ацетонитрил(50/50)Скорость потока:1,0 мл/минУсловия детектирования:SIMрежимвнегативнойполярности,m/z=168,10; фрагментатор 1302.3.4.6.5 Определение витамина СОбъем пробы:10 мклКолонка:Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкмПодвижная фаза:вода, подкисленная НСООН (1 мл муравьинойкислоты на 1 л воды, рН = 4,5) /ацетонитрил(50/50)Скорость потока:1,0 мл/минУсловия детектирования:SIMрежимвнегативнойполярности,59m/z=175,00; фрагментатор 702.3.4.6.6 Определение витамина D3Объем пробы:10 мклКолонка:Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкмПодвижная фаза:вода, подкисленная НСООН (1 мл муравьинойкислоты на 1 л воды, рН = 4,5) /ацетонитрил(10/90)Скорость потока:1,0 мл/минУсловия детектирования:SIMрежимвпозитивнойполярности,m/z=391,20; фрагментатор 1302.3.4.6.7 Определение витамина KОбъем пробы:10 мклКолонка:Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкмПодвижная фаза:вода, подкисленная НСООН (1 мл муравьинойкислоты на 1 л воды, рН = 4,5) /ацетонитрил(25/75)Скорость потока:0,8 мл/минУсловия детектирования:SIMрежимвнегативнойполярности,m/z=450,30; 450,40; фрагментатор 170Поскольку стандартизация готовой ЛФ - твердых желатиновых капсул сСЭРШК проводилась по основным действующим веществам, содержащимся внаибольших количествах – салидрозиду, аскорбиновой кислоте и кверцетину,разработанная методика ВЭЖХ/МС для определения витаминов применяласьдля их идентификации в составе ЛРС столбиков с рыльцами кукурузы, сухогоэкстракта кукурузы и выбора на основе количественных показателей наиболееэффективного метода экстракции – валидация данной методики не проводилась.2.3.3 Статистические методы анализаМатематические методы статистической обработки экспериментальных60данныхбылипроведеныОФС.1.1.0013.15эксперимента».всоответствиистребованиями«СтатистическаяобработкарезультатовЭкспериментальныеданные,представленныеГФРФхимическоговработе,являются результатом не менее пяти определений.2.3.4.
Валидация аналитических методикВалидация методик количественного определения стандартизуемыхвеществ(салидрозид,соответствиианалитическихсаскорбиноваятребованиямиметодик»поГФкислота)РФОФС.параметрам:ВЭЖХпроводилась1.1.0012.15линейность,в«Валидацияспецифичность,правильность, прецизионность, предел количественного определения.61Выводы к главе 2:1. В работе использовано современное высокоточное аналитическое итехнологическоеоборудование,своевременнопрошедшееповерку,чтогарантирует точность и правильность полученных результатов.2.Использованныевэкспериментахвспомогательныевеществаилекарственное растительное сырье соответствует требованиям НД.3. Для оценки качества ЛРС, гранулята и готовой лекарственной формыиспользовались фармакопейные методики.4.
Описаны методики идентификации и количественного определения БАВ всоставе ЛРС, гранулята и готовой лекарственной формы методами ВЭЖХ.62ГЛАВА 3. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПРОДУКТОВ И ПОЛУПРОДУКТОВТЕХНОЛОГИИПОЛУЧЕНИЯСУХИХЭКСТРАКТОВИЗЛРСРОДИОЛЫ РОЗОВОЙ, ШИПОВНИКА СОБАЧЬЕГО И КУКУРУЗЫМАЙСКОЙ3.1 Разработка методик подлинности и количественного определениябиологически активных веществ в лекарственном растительном сырье(корневища и корни родиолы розовой, плоды шиповника собачьего),извлечениях, готовом продуктеПри анализе данных литературы установлено, что химический составрастительного сырья «Корневище и корни родиолы розовой», «Плодышиповникасобачьего»весьмаразнообразен.Врастенияхсодержатсяфлавоноиды, органические кислоты, в частности, хлорогеновая, что даёт поводк разработке методики обнаружения и количественного определения сиспользованием одного метода определения этих БАВ как в извлечениях из них,так и в ЛП на их основе (твердые желатиновые капсулы с гранулятом).Согласнонормативнойдокументации–ГФРФ,отсутствуютрекомендации по идентификации действующих веществ в плодах шиповникасобачьего, а количественное определение проводится методом титрования,который являетсятрудоёмким[30].Методы идентификации основныхдействующих веществ в корневищах и корнях родиолы розовой такжеразнообразны.Кчислунаиболеераспространённыхотносятметодтонкослойной хроматографии (ТСХ) и качественная реакция на салидрозид [30,43, 69, 88, 103, 128, 129].Определение содержания салидрозида, содержащегося в корневище икорнях родиолы розовой по ГФ РФ проводится спектрофотометрическимметодом, пробоподготовка является многостадийным процессом, в ходекоторого возможны значительныепотери.Крометого, биологическуюактивность родиоле розовой придают также и такие БАВ, как розарин, розавин,розин и тирозол, но их определение в сырье и получаемых продуктах не63проводится.Распространенный метод идентификации действующих веществ вродиоле розовой – ТСХ, в основном применяется при качественном анализеЛРС.Количественноеопределениепроводят либо послеэлюированиядействующих веществ с хроматографической пластины и дальнейшим анализомспектрофотометрическим методом, либо с применением денситометра.
Также,идентификациясалидрозидаметодомТСХтребуетприменениятакихтоксичных веществ, как метанол и хлороформ. Возможно также использованиехроматографии на бумаге, однако к недостаткам этого метода следует отнестито, что бумага может быть изготовлена только из материалов на основецеллюлозы, что не позволяет применять ее для разделения неполярныхвеществ.Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенныхнедостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги,изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения,очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкаявоспроизводимостьрезультатов.Этинедостаткисерьезновлияютнаиспользование хроматографии на бумаге как хроматографического метода.Необходимо было разработать методику определения таких БАВ, какрозарин, розавин, розин и тирозол, салидрозид.К числу современных наиболее часто используемых инструментальныхметодов исследования относится метод ВЭЖХ [36, 49, 58].
Благодаря мягкостиусловий проведения ВЭЖХ (почти все разделения можно проводить притемпературах, близких к комнатной, при отсутствии контакта с воздухом),эффективности разделения, которую дает ВЭЖХ, высокой чувствительности,этотметодявляетсянезаменимымванализеБАВрастительногопроисхождения.Решение проблемы идентификации и количественного определения группдействующих веществ было реализовано при помощи разработанной методикиВЭЖХ, позволяющей в полной мере определить БАВ в сырье, полупродуктах и64готовом экстракте.Принимая во внимание физико-химические свойства анализируемыхсоединений, а также литературные данные в отношении методик определениясоединений, находящихся в растительном сырье «Корневища и корни родиолырозовой», «Плоды шиповника собачьего», было принято решение разработкиметодик для следующих групп, именуемых в дальнейшем: 1 группа (аскорбиновая кислота); 2 группа (хлорогеновая кислота, кверцетин); 3 группа (рутин); 4 группа (розарин, розавин, розин, салидрозид и тирозол).В качестве стандартов использовали стандарты фирмы «Сromodex»(вещества 4 группы), и стандарты фирмы «Sigma-Aldrich» для веществ 1-3группы.ВЭЖХ анализ полифенольных соединений проводили на жидкостномхроматографе фирмы Waters Breeze с УФ-детектором 2487.Дляколичественногоопределениясоединений1-4группыбылиприготовлены стандартные растворы: для 1-ой группы был приготовлен 10 мгаскорбиновой кислоты в 10 мл воды для хроматографии; 2-ой группы — по2,8 мгхлорогеновойкислотыикверцетинав10 млсмеси0,1 %трифторуксусной кислоты и ацетонитрила (в соотношении 50:50); для 3-ейгруппы — стандартный раствор: 7,1 мг рутина в 10 мл смеси 0,1 %трифторуксусной кислоты и метанола (в соотношении 50:50), и наконец, дляопределения соединений 4-й группы готовили стандартные растворы розарина,розавина, розина, салидрозида и тирозола в метаноле, с концентрацией каждогокомпонента 100 мкг/мл подвижной фазы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
