Диссертация (Роль сочетания наследственных тромбофилий и синдрома недифференцированной дисплазии соединительной ткани в патогенезе нарушений рецептивности эндометрия), страница 8

2.2, з),которые фотографировались отдельно, и вычислялась площадь каждой частиотдельно, потом они суммировались. После чего площадь каждого кусочкаэндометрия, вошедшего в срез, записывалась в протокол; после подсчетаплощади всех фрагментов они суммировались и выявлялась площадьпрепарата (рис. 2.2, ж). 3. При окраске пикрофуксином по Ван Гизонувыявлялись очаги склероза в эндометриальной строме. Их площадь тожеподсчитывалась. В оценке площади были некоторые сложности, посколькуколлагеновая сетка эндометрия и очаги склероза окрашивались примерноодинаково, очаги склероза чуть ярче.

В связи с этим оценка площади очаговсклероза проводилась по методике, приведенной в п.2, но на несколькозасвеченных фото, когда коллагеновая сетка из-за засветки пропадает, аостаются лишь очаги склероза, где соединительнотканные волокна лежатплотнее и хуже пропускают свет. После чего площади суммировались. 4.После оценки суммарной площади препарата и суммарной площади очаговсклероза второе делили на первое и результат выражали в процентах сточностью до тысячных долей процента, в дальнейшем вычислялись средниев группе значения этих процентов. 5. Оценку экспрессии коллагенов в очагахсклероза проводили следующим образом. а) для оценки брали участки,которые в аналогичных срезах при окраске по Ван Гизону имели красноеокрашивание (т.е., это действительно были очаги склероза). б) оценивалиплощадь экспрессии коллагенов 1 и 3 типа по методике, описанной в п.

2,после чего площади суммировались. в) В препарате выявлялось соотношение(Общая площадь экспрессии коллагена 1 типа в очагах склероза/общаяплощадь экспрессии коллагена 3 типа в очагах склероза) с точностью дотысячных долей единицы, в дальнейшем вычислялись средние в группе50значения этих соотношений. Результаты исследования заносили в протокол(рис. 2.2)2.2.4.

Иммуногистохимические методы исследования.Иммуногистохимическое исследование выполнялось на парафиновых срезах,изготовленных из пайпель-биоптатов, взятых у пациенток, вошедших висследование (табл. 2.1).Таблица 2.1.Количествообразцовтканиипроведенныхморфологическихииммуногистохимических исследованийГруппапациенток1 – нДСТ2 – НТ3 – нДСТ+НТ4 - контрольИтогоОбщееколичествообразцов ткани,включенных вморфологическоеииммуногистохимическоеисследованияКоличествосрезовдляморфологического исследованияКоличествосрезовдлягистохимическогоисследованияКоличество срезовдляиммуногистохимическогоисследования(включаяотрицательныеконтроли)132652286408016088019387641891836198811623241944Иммуногистохимические реакции проводились на депарафинированныхсрезахтолщинойполилизиновым4-5слоеммкм,расположенных(MаinzelGlаser,настеклах,Polylisine,покрытыхГермания).Депарафинирование срезов осуществляли в растворе Bioclear (Bio-Optica,Italy).Антигеннуюдемаскировкупроводиливводянойбанесмикропроцессором pT Link (Dako, Denmark) путем инкубации в 10 мМ51цитратном буфере рН 6.0 (Dako, Denmark) и автоматического нагрева буферадо 97 ̊ С, поддержанием этой температуры в течение 15 минут.

Далее стеклаостывали при комнатной температуре в течение около 20 минут. Остывшиестекла с целью блокировки эндогенной пероксидазы помещали во влажныекамеры и инкубировали в течение 15 минут с 3% раствором Н2О2, после чегосрезы ополаскивали в фосфатном буфере PBS (рН 7,0-7,6) и для блокированиянеспецифических белковых взаимодействий инкубировали с Ultrа-V-Block(LаbVision, USА) во влажных камерах в течение 30 минут. По окончанииинкубации стекла со срезами промывали буфером PBS и наносили первичныеантитела.В качестве первичных антител использовали антитела к рецепторамэстрогена (clone 1D5, Dako, Denmark, ready-to-use), к рецепторам прогестерона(clone 636, Dako, Denmark, ready-to-use), к белку PAI-1(cloneH-135,разведение 1:100, SantaCruz, USA), к белку VEGF-A (разведение 1:100,Abbiotec, USA), к белку LIF (разведение 1:100, Sigma, Sweden), к коллагену Iтипа (polyclonal rabbit antibody, 1:500, GeneTex, USA), к коллагену III типа(polyclonal rabbit antibody, 1:1000, GeneTex, USA), к белку MMP-2 (polyclonalrabbit antibody, 1:200, Abbiotec, USA), к белку MMP-9 (polyclonal rabbitantibody, 1:200, Abbiotec, USA), к белку fibronectin (rabbit antibody, 1:100, Dako,Denmark), к белку lamininВ2 gamma1 (mouse monoclonal antibody, 1:200,GeneTex, USA).Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 30 минутсогласнопредусмотреннойфирмой-производителемспецификациикантителу.

После завершения инкубации срезы тщательно отмывали вфосфатном буфере (рН 7,0-7,6) от первичных антител, не связавшихся сэпитопами. Для выявления первичных антител использовали полимернуюсистему, cодержащую декстрановый каркас с многократно присоединеннымимолекулами фермента пероксидазы хрена и вторичными антителами кантимышиным и антикроличьим иммуноглобулинам (EnVision, Dаko). Времяинкубации срезов с полимерной системой во влажных камерах составляло 3052минут. По окончании инкубации срезы ополаскивали в фосфатном буфере (рН7,0-7,6). Для визуализации места связывания антитела с антигеномиспользовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ)пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода с образованиемнерастворимого в органических растворителях конечного продукта реакции,который был виден в виде коричневого окрашивания структур клеток иэкстрацеллюлярного матрикса.

В зависимости от необходимой интенсивностиокрашивания срезы инкубировали с ДАБ в течение 5-10 минут. Далее стеклаополаскивали в дистиллированной воде и подкрашивали ядра гематоксилиномМайера (ООО «Эрго Продакшн», Россия) в течение 1 минуты. После этогостекла дегидратировали в ряде, состоящем из дистилированной воды, 70%спирта, 80% спирта, 2-х 95% спиртов, 2-х абсолютных спиртов и 3-х ксилолов.Далеесрезыпокрывалипокровнымистекламисиспользованиемсинтетической среды Shandon Mount (ThermoScientific, USA).Ставили отрицательные контроли – парафиновые срезы проводили поописаннойвышеметодикепроведенияиммуногистохимическогоисследования без добавления первичных антител.Оценкурезультатовиммуногистохимическихреакцийпроводиликоличественными и полуколичественными методами.Оценку степени экспрессии маркеров PgR, ER в эпителии и стромеэндометрия осуществляли посредством шкалы HistoScore по сумме тройногопроизведенияпроцентаинтенсивноокрашенныхклетоксдвойнымпроизведением процента умеренно окрашенных клеток и с однократнымпроизведением процента слабо окрашенных клеток, результат выражали впроцентах[145].

Рассчитывалистромальныйпрогестерон-эстрогеновыйиндекс (СПЭИ) – соотношение степени экспрессии прогестероновых рецептовв строме эндометрия к степени экспрессии эстрогеновых рецепторов в стромеэндометрия.Этотиндексиспользовалидляоценкирецептивностиэндометрия. За норму принимали СПЭИ в промежутке от 2 до 4 [146]. Оценкустепени экспрессии маркеров LIF, PAI-1, VEGF, MMP-2, MMP-9, fibronectin,53laminin осуществляли посредством подсчета окрашенных клеток одного типа.Оценку «-» (0 баллов) ставили, если окрашенные клетки отсутствовали.Оценка «1+» (2 балла) – от 1 до 20% окрашенных клеток.

Оценку «2+» (4балла) – при от 21 до 40% включительно окрашенных клеток. Оценку «3+» (6баллов) – при 41% и более окрашенных клеток.Оценку экспрессии коллагенов 1 и 3 типов в коллагеновой сетке стромыпроводили путем вычисления процента окрашенной стромы эндометрия в 5полях зрения на увеличении х100 с помощью морфометрическогопрограммного обеспечения AxioVision v.4.6.2. Если в препарате выявлялисьочаги склероза, то оценивали площадь экспрессии коллагенов 1 и 3 типов, атакже выявляли отношение окрашенной площади между коллагенами 1 и 3типов в этих очагах.Для каждой из групп рассчитывался средний балл экспрессии маркеров LIF,PAI-1, VEGF и стандартное отклонение.Для оценки рецептивности эндометрия использовали следующиепоказатели:морфологическаястадияэндометрияна20-22деньменструального цикла, процент зрелых пиноподий в поверхностном эпителииэндометрия, СПЭИ, степень экспрессии LIF в поверхностном эпителииэндометрия и пиноподиях.Считалось, что эндометрий рецептивен при сочетании следующихпоказателей:- средней стадии фазы секреции на 6-8 день менструального цикла;- наличия свыше 10% зрелых пиноподий в поверхностном эпителииэндометрия [57];- наличия умеренного периваскулярного отека [66];- СПЭИ от 2 до 4 [146];- высокой степени экспрессии LIF (6 баллов) в поверхностном эпителииэндометрия;- умеренной экспрессии VEGF в эндотелии сосудов.542.2.5 Статистические методы исследованияСтатистическая обработка проводилась с помощью программ Microsoft Excelи IBM SPSS Statistics 22.Для переменных, относящихся к интервальной шкале (возраст, степеньэкспрессии иммуногистохимических маркеров) при помощи построениягистограмм с расчетом среднего значения и стандартного отклоненияпроверялось, подчиняются ли их значения нормальному распределению.Посколькуполученноераспределениесущественноотклонялосьотраспределения Гаусса, при анализе применялись непараметрические методы,так же, как и для анализа переменных, относящихся к порядковой шкале(данные по выраженности клинических симптомов, степень выраженностиморфологических изменений).

При статистической обработке для оценкидостоверности различий средних значений между группами использовалисьследующие непараметрические критерии: U-критерий Манна-Уитни, Нкритерий Краскалла-Уоллеса. Для определения статистической значимостиразличий частот аллелей и генотипов в группах больных применялся критерийхи-квадрат. При оценке достоверности выявленных различий между среднимизначениями выборок рассчитывалась вероятность ошибки р.

Различиясчитались статистически значимыми при p<0,05.55Глава 3. Результаты.Для удобства результаты будут изложены по единому шаблону.3.1.Клиническая,морфологическаяииммуногистохимическаяхарактеристика группы контроля (группа №4)На основании выписок из медицинских карт пациенток группы контролябыли получены следующие данные: все включенные в исследованиепациенткинеимеликаких-либожалоб,неимелиотягощенногонаследственного анамнеза по наследственным тромбофилиям или синдромунДСТ, менструальная функция также была нормальной. У 9 пациенток,включенных в группу, суммарно в анамнезе было 11 беременностей, всебеременности завершились родами, протоколы IVF у пациенток группыконтроля не проводились. При физикальном исследовании у этих пациентокотклонения от нормы выявлены не были.