Диссертация (Возможности использования тканеинженерных конструкций в хирургическом лечении тазового пролапса), страница 11

В – 14 сутки, полное покрытие нити полипропиленовой сети.Увеличение × 200, фазовый контраст. Г- 30 сутки, стрелка указывает на полноезакрытие мелкой ячейки. Увеличение × 100, фазовый контраст.АБВГРисунок 46 - Титановая сетка с ДФ кожи крысы Вистар: А – 3 сутки послеимплантации, стрелка указывает на адгезирующую клетку на поверхности нити.Увеличение × 100, фазовый контраст. Б – 5 сутки, стрелки указывают на74множественные адгезирующие клетки на поверхности нити.

Увеличение × 100,фазовый контраст. В – 14 сутки, стрелка указывает на размножающиеся клетки вуглу между нитями. Увеличение × 200, фазовый контраст. Г- 30 сутки, стрелкауказывает на полное закрытие мелкой ячейки. Увеличение × 100, фазовыйконтраст.АБВРисунок 47 - Викриловая сетка с ДФ кожи крысы Вистар: А – 3 сутки послеимплантации, стрелка указывает на адгезирующую клетку на поверхности нити.Увеличение × 100, фазовый контраст Б – 5 сутки, стрелки указывают намножественные адгезирующие клетки на поверхности нити. Увеличение × 100,фазовый контраст. В – 14 сутки, стрелка указывает на размножающиеся клетки вуглу между нитями.

Увеличение × 200, фазовый контраст.75АВБГРисунок 48 - Композитная сетка с ДФ кожи крысы Вистар: А – 3 сутки послеимплантации, стрелка указывает на адгезирующую клетку на поверхности нити.Увеличение × 100, фазовый контраст Б – 5 сутки, адгезирующие клетки на втолще волокон нити. Увеличение × 100, фазовый контраст. В – 14 сутки, стрелкауказывает на размножающиеся клетки между волокнами нити. Увеличение × 200,фазовый контраст.

В – 14 сутки, клетки покрыли все волокна нитей, переходят насоединения нитей в углах. Увеличение × 200, фазовый контраст.Рисунок 49 - Биологический имплантат с ДФ кожи крысы Вистар: 30 сутки посленанесения клеток на поверхность, образование нескольких слоев клеток.Увеличение × 100.763.1.2. Оценка жизнеспособности клеток в тканеинженерной конструкциифасцииПодтверждениепервоначальногопокрытияповерхностейнитейдермальными фибробластами с дальнейшим заполнением ячеек сеток быловыполнено с помощью конфокальной микроскопии. Начало закрытия ячеекклетками начиналось на 12-14 сутки с момента культивирования клеток на сетку(рисунок 50).

Закрытие большей части ячеек многослойной клеточной структуройнаблюдали к 30 суткам (рисунок 51), а окончательное формированиежизнеспособных тканеинженерных конструкций на всех видах матриксовфиксировалось к 60 суткам. Оценка жизнеспособности клеток проверялась припомощи окраски LIVE/DEAD (зеленые клетки –живые; красные - мертвые).Однако, уже к 45 суткам удавалось получили прототип многослойной тканипокрытый несколькими слоями жизнеспособных клеток, способных к делению иразмножению (в качестве армирующей структуры – сетка или биологическийимплантат) (рисунок 52).Рисунок 50 - Сетка полипропиленовая, нить покрыта живыми ДФ крысы, 12 суткикультивирования.

Конфокальная микроскопия. Окраска LIVE/DEAD (зеленыеклетки –живые; красные - мертвые).77АБВРисунок 51 - 30 сутки культивирования дермальных фибробластов на матриксах:А- полипропиленовая сетка, оставшаяся незакрытой ячейка сетки с живымидермальными фибробластами, расположенными в несколько слоев; Б – титановаясетка, покрытые нити сети живыми ДФ; В – биологический имплантат,пророщенный ДФ. Конфокальная микроскопия. Окраска LIVE/DEAD (зеленыеклетки –живые; красные - мертвые).АБРисунок 52 - 45 сутки культивирования: многослойная ткань, состоящая издермальных фибробластов и армирующей сетки, биологического имплантата: А полипропиленоваясетка;Б–биологическийимплантат.Конфокальнаямикроскопия.

Окраска LIVE/DEAD (зеленые клетки –живые; красные - мертвые).783.2. Динамическое сравнение тканевых реакций на имплантаты и ТИК на ихосновеНа двух этапах исследования сравнивалась тканевая реакция, возникающаяна контрольные имплантируемые хирургические сетки из полипропилена иопытные тканеинженерные конструкции из различных материалов в условиях invivo (конструкции устанавливались в подапоневротическое пространство напередней брюшной стенке и в пространство под собственной фасциейтрапециевидной мышцы в межлопаточной области).Методика первого этапа исследования: полипропиленовые сетки размером10х10 мм имплантировали под кожу крысам справа и слева от средней линии наживоте под апоневроз.

Первая группа – контроль (нативная сетка), вторая группа– опыт – (сетка с аутологичными МСК КМ). Через 2 и 4,5 месяца образецвырезался, парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивались гематоксилинэозином, пикрофуксином по Ван - Гизону, изучались в микроскопе OlympusBX51, фотографировались с помощью видеокамеры фирмы Спецтехника(Москва) и программы Launch CAM VIEW.Первый контрольный срок - 2 месяца после имплантации.В контрольном препарате визуализируется полипропиленовая сетка, нитикоторой окружены со всех сторон зрелой соединительной тканью. Сами нитивыпали при резке препарата, оставив лишь округлую или овальную полостьвзамен.

Зрелая соединительная ткань с обеих сторон сетки состоит изколлагеновых волокон, окрашивающихся по Ван - Гизону фуксинофильно, ифибробластов (рисунок 53). Каждая из нитей сетки окружена собственной тонкойкапсулой, причём на границе этой капсулы и нити видны скопления макрофагов игигантских многоядерных клеток инородных тел (рисунок 54). В соединительнуюткань, окружающую сетку, включены отдельные мышечные волокна, чтосвидетельствует о распространении фиброза на близлежащие мышцы.

Следуетотметить, что воспалительная инфильтрация соединительной ткани на этот срок79минимальна. Только в отдельных участках отмечается небольшие инфильтраты,состоящие из лимфоцитов, макрофагов и единичных плазматических клеток(рисунок 55)Рисунок 53 -Контрольная сетка, 2 месяца с момента имплантации. Зрелаясоединительная фуксинофильная ткань вокруг полипропиленовой сетки. Окраскапо Ван-Гизону, увеличение х 200.Рисунок 54 - Контрольная сетка, 2 месяца с момента имплантации. Полости,оставшиеся от полимерных нитей, окружены собственной капсулой, макрофагамии гигантскими клетками. Окраска ГЭ, увеличение х 400.Рисунок 55 - Контрольная сетка, 2 месяца с момента имплантации.

Небольшойлимфо-макрофагальный инфильтрат в соединительной ткани. Окраска ГЭ,увеличение х 400.80Так же как и в контроле, в области имплантации полимерной сетки,покрытой мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга крысы,образуется соединительная ткань, в которую вмурованы нити этой сетки (рисунок56). Между соединительной тканью имакрофаговилимфоцитоввидныотдельными нитями сетки кроменейтрофильныелейкоциты,местамимногочисленные (рисунок 57). В соединительной ткани, окружающей сетку,воспалительная инфильтрация выражена также сильнее, чем в контроле. Средивоспалительногоинфильтратаувеличиваетсясодержаниемакрофаговиплазматических клеток с примесью нейтрофилов, что свидетельствует о болееактивной воспалительной реакции на сетку с мезенхимальными стромальнымиклетками костного мозга (рисунок 58).

Окраска по Ван-Гизону свидетельствует отом, что соединительная ткань вокруг сетки менее зрелая: плотностьфуксинофильных коллагеновых волокон там меньше, чем в контроле (рисунок59).Рисунок 56 - Опытная сетка (полипропиленовая сетка с нанесенными МСК КМкрысы),2месяцапослеимплантации.Полимернаясетка,окружённаясоединительной тканью.

Между сеткой и нитями макрофагальная реакция спримесью нейтрофилов. Окраска ГЭ, увеличение х 200.81Рисунок 57 - Опытная сетка (полипропиленовая сетка с нанесенными МСК КМкрысы), 2 месяца после имплантации. Нейтрофильная инфильтрация вокруг нитейсетки. Окраска ГЭ, увеличение х 400.Рисунок 58 - Опытная сетка (полипропиленовая сетка с нанесенными МСК КМкрысы),2месяцапослеимплантации.Макрофагально-нейтрофильнаяинфильтрация в соединительной ткани. Окраска ГЭ, увеличение х 400.Рисунок 59 - Опытная сетка (полипропиленовая сетка с нанесенными МСК КМкрысы), 2 месяца после имплантации. Рыхлая соединительная ткань, не плотнорасположенные фуксинофильные волокна.

Окраска по Ван-Гизону, увеличение х200.Второй контрольный срок – 4,5 месяца с момента имплантации.82В контрольных образцах, как и в сроке 2 месяца, полипропиленовая сетказамурована в соединительной ткани. Однако значительным отличием являетсярезко выраженная воспалительная инфильтрация этой ткани (рисунок 60).Инфильтрат состоит в основном из макрофагов, в меньшей степени лимфоцитов иплазматических клеток с примесью нейтрофилов. Сосуды в этой соединительнойткани резко расширены и полнокровны. Ткань очень рыхлая, отёчная,коллагеновые волокна либо пикринофильны, либо фуксинофильны по ВанГизону, но сильно разрыхлены.