Диссертация (Возможности использования тканеинженерных конструкций в хирургическом лечении тазового пролапса), страница 13

Отмечается формированиетрабекулярного каркаса из волокон соединительной ткани с отсутствием какихлибо воспалительных изменений. Окраска ГЭ, увеличение х 200.Тканевая реакция, возникающая на имплантацию ТИК на основе викриловойсетки к 7, 14, 21 суткам в условиях in vivo:При имплантации викриловой сетки через 7 суток после установки ТИКотмечалась экссудативная воспалительная реакция, характеризующаяся отеком ичастичными деструктивными изменениями. Умеренно выраженная лейкоцитарнаяинфильтрация сопровождалась выраженным в различной степени разрушениемклеток, сосудов, денатурацией коллагенового матрикса (рисунок 69). Однако,сохранялись отдельные сосуды и фибробласты. На этом сроке уже начиналосьформированиегрануляционнойткани,состоящейизбеспорядочнорасположенных веретеновидных фибробластов и тонких слабо фуксинофильныхили пикринофильных незрелых коллагеновых волокон.

В этой ткани содержались91также многочисленные новообразованные сосуды и умеренное количество клетоквоспалительного инфильтрата (лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов).Рисунок 69 - ТИК на викриловой сетке с ДФ крысы, 7 сутки. Отмечаетсяэкссудативнаявоспалительнаяреакция(отек,частичныедеструктивныеизменения и умеренно выраженная лейкоцитарная инфильтрация), денатурацияколлагенового матрикса. Окраска ГЭ, увеличение х 200.На14суткипроисходилоформированиепсевдокапсулывокругимплантируемого материала, представляющей собой молодую соединительнуюткань с довольно большим числом клеток, преимущественно фибробластов,сосудов и коллагеновых волокон, с формированием фибробластно-коллагеновогокаркаса вокруг (рисунок 70). Отмечалась умеренно выраженная гигантоклеточнаяреакция.

Содержание фуксинофильных коллагеновых волокон в этой ткани былоувеличено, волокна образовывали пучки.92Рисунок 70 - ТИК на викриловой сетке с ДФ крысы, 14 сутки. Отмечаетсяформирование псевдокапсулы вокруг сетки, представляющей собой молодуюсоединительную ткань с фибробластами, сосудами и коллагеновыми волокнами.При имплантации викриловой сетки через 21 сутки после операциинаблюдалось ее полное срастание с прилежащими тканями (рисунок 71). Вокругпереплетений сетки в основном оказывалась фиброзная ткань, которая заполняласоты, формируя единую плотную структуру (“заплату”). Местами, вокругэлементов сетки, четко прослеживались гранулемы инородных тел, встречалисьнебольшие островки грануляционной ткани. В процессе созревания тканьпревращалась в фиброзную. В образованной соединительной ткани выявлялисьфуксинофильные коллагеновые волокна и пиронинофильные фибробласты, чтоуказывало на активность белок-синтетических процессов (синтез коллагена).Эластичные же волокна не прослеживались.93Рисунок 71 - ТИК на викриловой сетке с ДФ крысы, 21 сутки.

Отмечаетсясрастание сетки с окружающими тканями. В образованной соединительной тканивыявлялисьфуксинофильныеколлагеновыеволокнаипиронинофильныефибробласты, что указывает на синтез коллагена. Окраска ГЭ, увеличение х 100.Тканевая реакция, возникающая на имплантацию ТИК на основе композитнойсеткой на 7, 14 сутки в условиях in vivo:На 7 сутки после имплантации отмечалась экссудативная воспалительнаяреакция,характеризующаясяинфильтрацияразрушениемФиксировалисьотеком, умеренно выраженной лейкоцитарнаясопровождающаясяклеток,сосудов,многочисленныевыраженнымденатурациейвразличнойколлагеновогоновообразованныесосудыистепениматрикса.умеренноеколичество клеток воспалительного инфильтрата (лимфоцитов, макрофагов).

Вдругом образце вокруг материала определялось наличие сформированногофибробластного каркаса, остатки материала практически без его резорбции. Втонких соединительнотканных прослойках, отмечались поля ангиогенеза ипролиферации сосудов. Важной особенностью в данных сроках являлось то, что в94ответ на имплантацию отвечали клетки фибропластического ряда, полностьюотсутствовал ответ и инфильтрация клетками воспалительного ряда, т.е.лимфоцитами, нейтрофилами и макрофагами.

В материалсетки втягиваласьтакже и жировая ткань, что создавало представление о ее «врастании» (рисунок72).Рисунок 72 - ТИК на композитной сетке с ДФ крысы, 7 сутки. Отмечаетсяэкссудативнаявоспалительнаяреакция(отек,умеренновыраженнаялейкоцитарная инфильтрация, денатурацией коллагенового матрикса). А так же вматериалесетки втягивалась также и жировая ткань, что создавалопредставление о ее «врастании».

Окраска ГЭ, увеличение х 200.На14суткиимплантируемогосоединительнойотмечалосьматериала,тканьюизформированиекотораябылаколлагеновыхпсевдокапсулыпредставленаволокон,свокругмолодойформированиемфибробластно-коллагенового каркаса вокруг (рисунок 73). Гигантоклеточнойреакции не было отмечено.95Рисунок 73 - ТИК на композитной сетке с ДФ крысы, 14 сутки.

Отмечаетсяформирование псевдокапсулы вокруг сетки, которая представлена молодойсоединительной тканью из коллагеновых волокон. Окраска ГЭ, увеличение х 200.Тканевая реакция, возникающая на имплантацию ТИК с биологическимимплантатом, содержащим свиной коллаген на 21 сутки в условиях in vivo:Фиксировалась умеренная воспалительная реакция по краю имплантата, атакже колонизация материала клеточными элементами. Резкое полнокровиесосудов,микрокровоизлияния,отмечалосьналичиеперифокальнойвоспалительной реакции с формированием полей расширенных и местамиполнокровных сосудов, интерстициальным отеком (рисунок 74 А).В другом случае отмечалась неоваскуляризация имплантата. Реакцияотторжения инородного тела отсутствовала.

Значимого разрушения коллагеновойструктуры имплантата также не было отмечено. Активность воспалительнойреакции соответствовала нормальному течению раневого процесса (рисунок 74Б).96АБРисунок 74 - ТИК на биологическом имплантате с ДФ крысы, 21 сутки. А умеренная воспалительная реакция.

Отмечается резкое полнокровие сосудов,микро кровоизлияния, определяется наличие перифокальной воспалительнойреакции. Окраска ГЭ, увеличение х 100. Б - отмечалась неоваскуляризацияимплантата. Реакция отторжения инородного тела отсутствовала. Окраска ГЭ,увеличение х 100.3.3.Иммуногистоимическоеисследованиеимплантированныхтканеинженерных конструкций3.3.1. Оценка пролиферацииПри помощи иммуногистохимического анализа проводилась оценкастепени пролиферации (белок Ki-67), апоптоза (Caspase 3, Caspase 9),антиапоптоза (Bcl 2), ангиогенеза (СD 31, CD 51/61, Col3A1).Пролиферация является основной функцией клеток, с помощью которой нетолько осуществляется регенерация и восстановление отмирающих тканей, но ипо степени пролиферативной активности которой можно судить о нормальномросте клеток.

Пролиферативная активность оценивалась при помощи маркера –97антигена Ki 67. Для выявления степени выраженности была принята следующаяшкала:0–20% – низкая пролиферативная активность;21–50% – умеренная пролиферативная активность;51 –100% – высокая пролиферативная активность.Чем выше степень активности пролиферации, тем более выраженавоспалительная тканевая реакция на внедрение ТИК.Бионедеградируемая полипропиленовая сетка на сроках контроля (7, 14, 21сутки) показала снижение активности пролиферации. На 7-е сутки индекс Ki 67составил 30% (рисунок 75 А), к 14-м суткам отмечалось постепенное снижениепролиферации до 20%, а на 21 сутки – на уровне 10% (рисунок 75 Б). Данныепоказатели отразили наименее выраженную активность организма крысы навнедрение ТИК на полипропиленовой матрице.В качестве клеточногокомпонента использовались аутологичные дермальные фибробласты крыс.АБРисунок 75 - Участок ТИК на полипропиленовой сетке с ДФ крысы сокружающими тканями на 7 сутки (А) и на 21 сутки (Б) после имплантации.Иммуногистохимическая реакция с антителами к антигену Ki 67.Продукт реакции коричневого цвета.

Увеличение ×100.У другой ТИК на основе бионедеградируемой сетки из титана получилисхожие индексы Ki 67, которые составили: на 7 сутки – 30%, на 14-е сутки – 20%(рисунок 76). Данные показали так же отражают умеренный уровеньпролиферативной активности.98Рисунок 76 - Участок ТИК на титановой сетке с ДФ крысы с окружающимитканями на 14 сутки (после имплантации. Иммуногистохимическая реакция сантителами к антигену Ki 67.

Продукт реакции коричневого цвета. Увеличение×100.ТИК на основе композитной сетки с аутологичными ДФ крысыотносительно активности пролиферации показала следующие результаты:уровень ядерной экспрессии на 7 сутки составил 50%, что отражало умереннуюпролиферативную активность; к 14 суткам – оставался на уровне 30%; а к 21суткам снижался лишь до 20-25% (рисунок 77). На всех сроках исследованияпролиферативная активность оставалась на умеренном уровне.Рисунок 77 - Участок ТИК на композитной сетке с ДФ крысы с окружающимитканями на 21 сутки после имплантации. Иммуногистохимическая реакция сантителами к антигену Ki 67. Продукт реакции коричневого цвета.

Увеличение×100.Индекс Ki 67 на имплантацию ТИК на основе биологического имплантата саутологичными ДФ к 21 суткам составил лишь 25%, что отразило умеренную99пролиферативную активность клеток крысы на внедрение конструкции (рисунок78).Рисунок 78 - Участок ТИК на основе биологического имплантата из свиногодермального коллагена с аутологичными ДФ крысы с окружающими тканями на21 сутки после имплантации. Иммуногистохимическая реакция с антителами кантигену Ki 67. Продукт реакции коричневого цвета. Увеличение ×100.Графики иммунохимических реакций с антителами к антигену Ki 67 в ответна имплантацию ТИК на различных матриксах отражены в таблице 4.60504030207 сутки1014 сутки021 суткиТаблица 4 - Оценка пролиферативной активности (уровень экспрессии Ki 67):0–20% – низкая пролиферативная активность,21–50% – умеренная пролиферативная активность,51 –100% – высокая пролиферативная активность.1003.3.2.

Оценка апоптотических процессовКаспазы — это протеазы, имеющие в активном центре остаток цистеина, иразрезают свои субстраты по специфическому остатку аспарагиновой кислоты(отсюда название: c от cysteine и asp от aspartic acid). Каспазы синтезируются вклетке в виде неактивных прокаспаз, которые могут становиться субстратами длядругих, уже активированных каспаз, что режут их водном или двух местах по иостатку аспартата.Инициаторные каспазы (Caspasa −2, −8, −9, −10, −12) активируютэффекторные каспазы (Caspase−3, −6, −7), которые в свою очередь провоцируют инепосредственно участвуют в трансформации клетки. В итоге морфологические ибиохимические изменения приводят к гибели клетки по типу апоптоза.Степеньвыраженностибиодеградируемомапоптоза(биологическийпроверяласьимплантатизнаТИКсвиногонаосновеколлагена)ибионедеградируемых (полипропиленовая и титановая сетка) матриксах.При этом на ТИК с биологическим имплантатом отмечалась выраженнаяэкспрессия Caspasa-3, указывающая на активационные проапоптотическиеCaspasa-3 - зависимые процессы, приводящие к апоптотической гибелифибробластов (рисунок 79).Рисунок 79 - Участок ТИК на основе биологического имплантата из свиногодермального коллагена с аутологичными ДФ крысы с окружающими тканями на21 сутки после имплантации.