Диссертация (Возможности использования тканеинженерных конструкций в хирургическом лечении тазового пролапса), страница 10

Окрашенные образцы из чашек для in vitro культивирования63переносились на стерильные чашки Петри с тонким стеклянным дном толщиной0.16 мм в растворе PBS. Для получения изображений использовали объектив ECPlan-Neo fluar 10x/0.3/М27. 3D изображения получали путем реконструкции Zстеков, получаемых при сканировании в режиме 1024×1024 пикселей (850×850μм), при конфокальной диафрагме диаметром 34 μм, скорости сканирования 0,64μс/пиксель.Врезультатеполучалиналожениефлуоресцентныхизображенийлокализаций акридинового оранжевого (зеленый цвет), этидиума бромида(красный цвет) и изображения, полученного в режиме проходящего света (при 3D- реконструкции режим проходящего света не включали в общее наложение).Оценка скорости закрытия ячеек сетки и образования монослоя издермальных фибробластов и мезенхимальных стромальных клеток костного мозгапроизводилась на 14, 21, 30 и 60 сутки после культивирования.После имплантации клеточно-инженерных конструкций лабораторнымживотнымпроизводилосьморфологическоеисследованиепослеокраскигематоксилином и эозином под световым микроскопом.

Сроки получениярезультатов – 7, 14, 21 сутки, 2 и 4,5 месяца.2.6. Иммуногистохимический метод исследования материалов, полученныхin vivo.Иммуногистохимическоеисследованиепроводилосьстрептавидин-биотиновым методом (George L. Kumar, Lars Rudbeck, 2011) 89. Цельокрашивания состоит в выявлении какого-либо антигена на срезе ткани припомощи специфически связывающихся с ним меченых антител [113], в результатечего на исследуемом срезе происходит связывание в единое целое антигена иантитела. В настоящее время фиксация конечного продукта реакции производится64при помощи ферментной метки (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза),котораяконъюгируетсясмолекулойантитела.Добавлениехромогенаосуществляется с целью выявления активности фермента в субстрате, врезультате реакции фермент-субстрат образует цветной нерастворимый осадок,который выпадет в местах локализации антигена.

Чаще всего антигеном являетсябелковая молекула, к которойподбираютсяспецифические антитела. Внастоящей работе были использованы коммерческие моноклональные антителафирм DAKO, Abcam, Bechman (Таблица 2): к CD 31 и CD 51/61- мембраннымбелкам (маркерам эндотелия); к Col3A1 - гену, кодирующему аминокислотнуюцепь протеида альфа-1 и белковой основы соединительной тканей – коллагена; ккаспазам (Caspase 3 и Caspase 9) – белкам протеолитической системы,являющихся центральным звеном в механизме апоптоза (Caspase 9 – одна изкаспаз обратимого апоптоза, необходимая для узнавания и передачи сигналаклеточной гибели; Caspase 3 – вовлекается в процесс необратимого расщепленияструктурных компонентов жизнеобеспечения клетки, участвует в регуляциимежгенных взаимодействий, восстановлении ДНК и ядерной мембраны) [114]; кBcl 2 – антиапоптотическому маркеру (Всl 2 – один из основных регуляторовапоптоза, может останавливать апоптоз, опосредуемый белком р53 или инымимеханизмами; Bcl 2 белок, локализован в митохондриях, эндоплазматическомретикулумеиперинуклеарноймембране.Онподавляетестественнопроисходящую клеточную гибель предположительно путем регуляции транспортакальция в клетке).Таблица 2.

Антитела и визуализационные системы, использованные в работеБелок/Визуализационная системаCaspase 3ХарактеристикаМаркер апоптоза(расщеплениекомпонентов клетки)ХарактеристикаПроизводительантител:Антителразведение, клонМоноклональные,Abcam,1:50, Клон E87USA65Caspase 9Bcl 2CD 31CD 51/61Col3A1Маркер апоптоза(сигналы к апоптозу)АнтиапоптотическиймаркерМембранный белок,относящийся кклассу молекулклеточной адгезии(маркер эндотелия)Мембранный белок(маркер эндотелия)Ген, кодирующийаминокислотнуюцепь протеида альфа1 и белковой основысоединительнойтканей – коллагена.Изменения локуса2q32.2Окончание таблицы 2Моноклональные,1:100, Клон E231:15Моноклональные,1:10, Клон JC/70AМоноклональные,23 C6 (isotype:mouse Ig G1κ).Разведение 1:25Abcam,USADAKO,DenmarkDAKO,DenmarkBeckmanCoulter,FranceГенетическиймаркер G1245T, вкоторомпроисходитзамена гуанина(G) на тимин (Т)Полуколичественная шкала, использованная для оценки результатовиммуногистохимических исследований, представлена в таблице 3.66Таблица3.Полуколичественнаяшкалаоценкирезультатовиммуногистохимических исследованийМорфологическийпризнакОценка,баллЗначениеВыраженностьспецифическойреакции0Нет экспрессии1Есть единичные окрашенные клетки (не в каждомиз 10 полей зрения при увеличении ×100)2Есть скопления окрашенных клеток в каждом полезрения или скопления окрашенных клеток свысокой экспрессией не в каждом поле зрения притом же увеличении.3Есть скопления окрашенных клеток с высокойэкспрессией в каждом поле зрения при том жеувеличенииДепарафинированиесрезовитепловоедемаскированиеантигеновпроводилось при помощи автоматической системы иммунного окрашиванияBench Mark (Ventana, США).2.7.

Оценка тканевой реакции.Тканевую реакцию оценивали по интенсивности, которая представленабалльной шкалой от 1 (отсутствие отклонения признака) до 5 (максимальноепроявление признака). Производилась оценка биорезорбции, макрофагальнойреакции на материал, токсичность матрикса, иммунореактивность, степеньангиогенеза, выраженность микрососудистых повреждений, толщину и зрелостькапсулы, окружающей эндопротез.Индекс пролиферации считали суммой баллов к максимальному количествубаллов, по следующим критериям: ангиогенезу, капсуле и биорезорбции. Индексвоспаления считали суммой баллов к максимальному количеству баллов, по67следующим критериям: токсичности, иммунореактивности, микрососудистымповреждениям. Регенеративный индекс рассчитывали как отношение индексапролиферации к воспалительному индексу.2.8.Статистическая обработка данных.Проводили в Graph Pad Prism П версии 7.00.

Достоверность различий врегенеративноминдексемеждуисследуемымигруппамивыявлялидисперсионным анализом (one-way ANOVA) с поправкой на множественныесравнения Тьюки. Статистические различия считали значимыми при p значении <0.05. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Характеристика тканеинженерной конструкцииТканеинженерная конструкция в качестве макроскопического препаратапредставляет собой матрикс из бионедеградируемого, композитного илибиодеградируемого материала (рисунок 36). При увеличении под световыммикроскопом визуализируются отдельные клетки, покрывающие нити сетчатогоматериала, после полного покрытия нитей клеточный компонент начинаетразрастаться в области углов – перекрестов нитей в сторону середины отверстия(постепеннозакрываявсепространствоклетками)(рисунок37).Жизнеспособность полученных конструкции оценивалась с использованиемлазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss) сокраской LIVE/DEAD (рисунок 38).68Рисунок 36 - Фрагмент тканеинженерной конструкции (на примере матрикса изполипропиленовой сетки).АБРисунок 37 - А - Сетчатый матрикс с МСК крысы на 3 сутки культивирования.Стрелка указывает на адгезивную клетку в месте переплёта нитей.

Б – отмечаетсяначало заполнения ячеек после завершения заполнения поверхности нитей сетокна 12 сутки культивирования.. Увеличение × 100, фазовый контраст.А69БРисунок38-А-Сетчатыйэндопротез, покрытыймезенхимальнымистромальными клетками костного мозга крысы на 27 сутки культивирования. Б –Сетчатый матрикс, покрытый дермальными фибробластами кожи крысы на 30сутки после нанесения. Визуализируется одна плоскость. Конфокальная лазернаямикроскопия, окраска LIVE/DEAD (зеленые клетки – живые; красные – мертвые).3.1.1. Динамика пролиферации клеток in vitro.Микроскопический метод исследования использовался для контроля ростаклеточной культуры в чашках Петри (рисунок 39 А, Б), а так же производиласьежедневнаяоценкаобразованиямонослоядермальныхфибробластовимезенхимальных стромальных клеток костного мозга на биодеградируемых,композитных и бионедеградируемых матриксах.АБРисунок 39 - Первичная культура клеток на 1-е сутки после нанесения на70матрицы: А – дермальные фибробласты крысы, Б- мезенхимальные стромальныеклетки костного мозга крысы.

Увеличение ×200, фазовый контраст.На первом этапе исследования в качестве клеточного компонентаиспользовали мезенхимальные стромальные клетки костного мозга крысы (МСККМ). Получение клеточной культуры производили путем пункции аспирационнойиглой эпифиза бедренных костей у лабораторных крыс Wistar (самцов) (рисунок40).Рост клеточной культуры оценивался на 3 (рисунок 41), 6 (рисунок 42) и 14сутки с применением световой микроскопии.Рисунок 40 - Первичная культура мезенхимальных стромальных стволовыхклеток костного мозга крысы до момента нанесения на сетчатые имплантаты.Увеличение ×100, фазовый контраст.АБРисунок 41 – 3 сутки с момента культивирования. В качестве матрикса полипропиленовая сетка, клеточная культура - МСК КМ крысы. А - Стрелкауказывает на адгезированную клетку.

Б - Адгезированные клетки на поверхностипрозрачной нити. Увеличение × 200, фазовый контраст.71Рисунок 42 - Хирургическая полипропиленовая сетка с нанесенными МСК КМкрысы на 6 сутки с момента культивирования. Продолжается рост клеточнойкультуры, колонии клеток почти полностью покрыли поверхность нитей.Увеличение × 200, фазовый контраст.На 14 сутки с момента культивирования закрытие мелких ячеек постоянноувеличивающимися колониями клеток. Отмечалось начало закрытия болеекрупных ячеек сетчатого имплантата (рисунок 43).АБРисунок 43 - Сетчатый полипропиленовый имплантат с нанесенными на негоМСК КМ крысы на 14 сутки с момента культивирования. А – общий вид сетки. Б- стрелка указывает на образование монослоя клеток в проекции мелкой ячейкисетки.

Увеличение × 40, фазовый контраст.На втором этапе исследования в качестве клеточного компонентаиспользовали дермальные фибробласты. Производили забор базального слояэпидермиса кожи у лабораторных крыс Вистар размером 5х5 мм (рисунок 44).72Далее производили процесс характеризации клеток для получения первичнойкультуры дермальных фибробластов.Рисунок 44 - Первичная клеточная культура дермальных фибробластов крысы (1е сутки культивирования). Увеличение ×200, фазовый контраст.В ходе исследования проводили оценку динамики образования ТИК наразличных матриксных поверхностях: полипропиленовая (рисунок 45), титановая(рисунок 46), викриловая (рисунок 47), композитная (рисунок 48) сетки,биологический имплантат (рисунок 49).

На каждый имплантат наносили 250 мклклеточной суспезии (400 тыс. клеток).Контроль проводили на 3, 5, 14, 30 сутки. На 3 сутки отмечали адгезиюотдельных клетки на поверхности матриксов. К 5 суткам количество отдельныхклеток возрастало, они начинали частично покрывать поверхность нитейхирургических сеток. 14 сутки культивирования – происходило полное покрытиенитей сетки и начало закрытия ячеек сетки. К 30 суткам происходило завершениеобразования монослоя клеток в мелких ячейках.АБ73ВГРисунок 45 - Сетчатый полипропиленовый имплантат с ДФ кожи крысы Вистар:А – 3 сутки после имплантации, стрелка указывает на отдельные адгезирующиеклетки на поверхности нити. Увеличение × 100, фазовый контраст. Б–5 сутки,стрелки указывают на частично покрытые поверхностью нити. Увеличение × 100,фазовый контраст.