Диссертация (Влияние структуры агликона на иммунотропную активность гликозидов мурамилдипептида), страница 13

Высокий уровень IL-6 сохранялся спустя 24 часапосле введения препаратов, что может отражать не только высвобождениеэтого и некоторых других цитокинов под влиянием иммуностимулятора, но истимуляцию их синтеза de novo.В этом же контексте примечательно повышение концентрации IL-10через 8 часов после введения препарата, указывающее на активацию икомпенсаторного противовоспалительного каскада.Таким образом, β-гептилгликозид МДП вызывал самоконтролируемыйвоспалительный процесс.

Можно предположить, что применение этогогликозида МДП в качестве иммуностимулятора способно во многихклинических ситуациях предотвратить хронизацию инфекционного процессаи придать ему циклических характер.Отмеченное повышение концентрации IFN-γ через 1 час в сывороткеживотных экспериментальной группы указывало на раннюю активациюмеханизмов противовирусной защиты. Уровень IFN-γ снизился до значенийравных показателям контрольной группы через 8 часов после введения βгептилгликозида МДП, что говорит о транзиторном характере усилениясинтеза или только о высвобождении внутриклеточного пула этого цитокина,синтезированного ранее.Рост концентрации IL-5 отражает потенцирование гуморальногоиммунного ответа. В то же время отсутствие статистически значимыхизменений уровня IL-2 указывает на неполную стимуляцию B-клеточныхреакций.Повышение содержания IL-4 и IL-17 после введения β-гептилгликозидаМДП указывает на стимуляцию компонентов антительного ответа, зависимых114от Th2- и ILC-2-клеток, и Th17/ILC-17-ассоциированные мобилизацию иактивацию нейтрофильных гранулоцитов.Несмотря на множество исследований, направленных на изучениепротивоопухолевогоиммуноцитовииммунитета,опухолевыхточныеклетокмеханизмыостаютсявовзаимодействиямногихаспектахнераскрытыми.

Опухолевые клетки способны оказывать влияние как наэффекторные популяции иммунных клеток, так и на регуляторные популяции.Этодостигаетсякаксинтезомцитокиновихемокинов,такинепосредственным взаимодействием клеток. Опухолевые клетки способны нетолько подавлять популяции, ответственные за клеточный компонентиммунитета, но и использовать различные подвижные иммуноциты длядиссеминации и индукции ангиогенеза в опухоли.NK-клетки и цитотоксические T-лимфоциты являются основнымиэлементами непосредственной борьбы с опухолевыми клетками.

Как показалипредыдущиеисследования,гликозидыМДПвызываютповышениеактивности NK-клеток и аллоспецифических цитотоксических T-лимфоцитовпо отношению к клеткам-мишеням [18].Прививка мышам линии C57/Bl6 меланомы B16 воспроизводитобщепризнанную модель для оценки прямого и иммуноопосредованногопротивоопухолевого действия фармакологических веществ в условиях целогоорганизма.Припродолжительностиэтомторможениежизниявляютсяростаопухолиинтегральнымииувеличениепоказателямисовокупного противоопухолевого действия исследуемых веществ, в том числестимуляции ими противоопухолевого иммунитета.Для определения противоопухолевого потенциала β-гептилгликозидаМДП его вводили в профилактическом и терапевтическом режимах.Отсутствие статистически значимого ТРО и УПЖ у животных послепрофилактического введения препарата указывает на то, что транзиторныйиммуномодулирующий эффект β-гептилгликозида после однократногоприменения не способен оказывать значимое влияние на имплантацию115опухоли и дальнейшее течение опухолевого процесса.

Вместе с теммногократное введение препарата в терапевтическом режиме вызывалодозозависимый и стойкий эффект торможения роста опухоли, а такжеувеличениепродолжительностижизнимышей-опухоленосителей,получавших β-гептилгликозид МДП в дозе 5 мкг/животное.В тоже время у животных, получавших максимальную терапевтическуюдозупрепарата,призначимомТРОнеотмечалосьувеличенияпродолжительности жизни. Это может быть проявлением токсичностивысоких доз β-гептилгликозида МДП или индуцированных им эндогенныхвеществ.Доказана релевантность оценки норкового и поискового рефлексов улабораторных животных для суждения о функции ЦНС.

Известно, чторазвитие опухолевого процесса сопровождается подавлением активностиЦНС, в том числе снижением рефлексов. Кроме того, на функцию ЦНС могутоказывать некоторые иммунные медиаторы, такие как провоспалительныецитокины, выработку которых модулируют мурамилпептиды. Отсутствиеотличий рефлексов у животных-опухоленосителей, которым вводили βгептилгликозид МДП или такой же объем физиологического раствора,указывает на отсутствие прямой или опосредованной нейротоксичности уэтого препарата.Таким образом, проведенное исследование позволило уточнить влияниеструктуры агликона на иммуномодулирующую активность гликозидов МДПв отношении иммунокомпетентных клеток человека, и сделать еще один шагна пути создания на основе β-гептилгликозида МДП иммунотропногопрепарата, имеющего потенциал к внедрению в комплексное лечениеинфекционных и опухолевых заболеваний.116ВЫВОДЫ1) В концентрации 1 мкмоль/мл β-гликозиды мурамилдипептида (МДП)с алифатическими агликонами, также как и МДП, не влияли нацитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов крови человека;среди гликозидов с циклическими агликонами только β-циклооктилгликозидМДП повышал NK-зависимую цитотоксичность, а β-адамантилгликозид МДПснижал ее.

При увеличении концентрации до 10 и 100 мкмоль/мл наибольшуюактивность, сопоставимую с таковой у МДП, проявлял β-гептилгликозидМДП; увеличение числа атомов углерода в алифатической цепи агликона от 7до 12 коррелировало со снижением способности гликозидов МДПстимулировать NK-активность мононуклеарных лейкоцитов.2) β-Гептилгликозид МДП в концентрации 10 мкмоль/мл в той жестепени,чтоиМДП,увеличивалдолюнейтрофилов,активнофагоцитирующих частицы латекса в образцах цельной крови человека. Другиеβ-гликозиды МДП с алифатическими, циклическими и адамантильнымагликонами не влияли на фагоцитарную функцию нейтрофилов.3) МДП и β-гептилгликозид МДП повышали экспрессию CD14 надендритных клетках человека in vitro, но не изменяли статистически значимоэкспрессию других мембранных маркеров, характерных для созревающих изрелых дендритных клеток. При этом обнаружена выраженная тенденция кувеличению экспрессии СD83 под влиянием обоих гликопептидов, HLA-DR –под действием β-гептилгликозида МДП, а также тенденция к снижениюэкспрессии HLA-DR и СD86 – под влиянием МДП, комбинаций молекулCD80+HLA-DR и CD86+CD14 – под действием обоих гликопептидов.4) Через 1 час после внутрибрюшинного введения β-гептилгликозидаМДП в сыворотке крови мышей повышалось содержание IL-1β, IL-2, IL-4, IL6, IL-10, IFN-γ, TNF-α и GM-CSF; в большинстве случаев это соединениепревосходило МДП по цитокин-индуцирующей активности.

Через 8 часовпосле инъекции β-гептилгликозида МДП в сыворотке крови сохранялась117повышенная концентрация IL-1β и IFN-γ; в большей степени, чем подвлиянием МДП, возрастал уровень IL-5 и продолжалось увеличениесодержания IL-6 и IL-10; концентрация TNF-α сменяла восходящий тренд нанисходящий, оставаясь на уровне выше, чем в контроле; содержание IL-2, IL4 и GM-CSF практически возвращалось к контрольным значениям. Через 24часа после введения β-гептилгликозида МДП сохранялся более высокийуровень IL-6, чем после инъекции МДП; МДП в большей степени, чем βгептилгликозид МДП, поддерживал высокие концентрации IL-10 и TNF-α.5)β-ГептилгликозидМДПприповторныхвнутрибрюшинныхинъекциях в дозе 5 мкг/животное в терапевтическом режиме увеличивалпродолжительность жизни мышей C57Bl/6 с имплантированной меланомойB16; в дозах 5 и 25 мкг/животное этот гликопептид, кроме того, вызывалзначимое торможение роста опухоли.

При однократном профилактическомвведении β-гептилгликозид МДП статистически значимо не изменял рост узламеланомы и длительность жизни мышей-опухоленосителей.6)Внутрибрюшинноевведениеβ-гептилгликозидаМДПвтерапевтическом и профилактическом режиме не влияло на динамикуноркового и поискового рефлексов у мышей линии C57Bl/6 с привитоймеланомой B16.ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИРезультаты диссертационного исследования, углубляя и расширяяпредставления о спектре биологической активности β-гептилгликозида МДП,в том числе в отношении иммунокомпетентных клеток человека, позволяютрекомендовать этот гликопептид как перспективную субстанцию для созданияна ее основе иммунотропного лекарственного средства.118СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙВИЧ – вирус иммунодефицита человекаВГС – вирус гепатита СДК – дендритные клеткиДМСО – диметилсульфоксидЛПС – липополисахаридМДП – мурамилдипептидМНК – мононуклеарные лейкоциты периферической кровиCD – кластер дифференцировкиFITS – флуоресцеин-изотиоцианатGM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий факторHLA – человеческий лейкоцитарный антигенIFN-γ – интерферон-γIL – интерлейкинILC – лимфоидные клетки врожденного иммунитетаNLR – NOD-подобные рецепторыMCH II – главный комплекс гистосовместимостиTCR – T-клеточный рецепторTLR – Toll-подобные рецепторыTh – T-хелперыTNFα – фактор некроза опухоли αPAMP – патоген-ассоциированные молекулярные паттерныPRR – образ-распознающие рецепторы119СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ1.

Андронова Т.М. Ликопид (ГМДП) – современные представления. / Т.М.Андронова, Б.В. Пинегин, И.Г. Козлов // 5-е изд. доп. и перераб. М – 2009.2. Болтовская М.Н. Модель спонтанных абортов у мышей / М.Н.Болтовская, К.А. Артемьева, О.В. Калюжин, И.И. Степанова, Н.А.Старосветская. // Клиническая и экспериментальная морфология – 2014. – №3(11) – C.59-63.3. ЗемляковА.Е.ГликозидыN-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина.

Влияние конфигурации гликозидного центра и природыагликона на биологическую активность. / А.Е. Земляков, В.В. Цикалов, О.В.Калюжин и др. // Биоорган. Хим. – 2003. – №3 – C. 316–322.4. Земляков А.Е. Синтез гликозидных аналогов N-ацетил-мурамоил-Lаланил-D-изоглутамина. / А.Е. Земляков, В.Я. Чирва. // Химия природныхсоединений. – 1987. – N 5.

– С. 714–718.5. Иванов В.Т. Механизм действия и клиническая эффективностьиммуномодулятора глюкозаминилмурамил дипептида(ликопида). / В.Т.Иванов, Т.М. Андронова, В.А. Несмеянов и др // Клин. Мед. – 1997. – № 3 – C.11-15.6. КалюжинаМ.И.Способреабилитациибольныххроническимописторхозом после дегельминтизации. / М.И. Калюжина, О.В. Павленко, О.В.Калюжин, И.В. Савченко. // Свидетельство о государственной регистрацииПрЭВМ, рег. 2162336 от 26.01.2000. – М.: Роспатент, 2001.7. Калюжин О.В Амфифильный дериват мурамилдипептида в терапиимышиной лимфомы EL-4.

/ О.В. Калюжин, М.В. Нелюбов, Ф.Н. Кузовлев,М.И. Калюжина, А.Е. Земляков, М.В. Шкалев, Е.Л. Мулик, А.В. Караулов //Вопросы биологической, медицинский и фармацевтической химии – 2001. –№1 – C. 4546.8. Калюжин О.В. Влияние гидро-липофильного баланса производныхмурамилдипептида на их взаимодействие с биомембранами и включение в120клетки. / О.В. Калюжин, Б.Б. Фукс // Бюл. Экспер. Биол. Мед. – 1996.