Диссертация (Влияние структуры агликона на иммунотропную активность гликозидов мурамилдипептида), страница 8

Контрольная №2 (животным с опухолью вводился физиологическийраствор)3. β-Гептилгликозид МДП вводился в дозе 1 мкг/животное впрофилактическом режиме;4. β-Гептилгликозид МДП вводился в дозе 5 мкг/животное впрофилактическом режиме;5. β-Гептилгликозид МДП вводился в дозе 25 мкг/животное впрофилактическом режиме;6. β-Гептилгликозид МДП вводился в дозе 1 мкг/животное втерапевтическом режиме;7. β-Гептилгликозид МДП вводился в дозе 5 мкг/животное втерапевтическом режиме;8. β-Гептилгликозид МДП вводился в дозе 25 мкг/животное втерапевтическом режиме.Критериямиоценкидействияпрепаратовбылисредняяпродолжительность жизни (СПЖ) и торможение роста опухоли (ТРО).ТРО определяли на основании измерения линейных размеровподкожной опухоли с вычислением объема опухоли (V).

Эффективностьпроведенного лечения была оценена по величине ТРО, которую вычисляли поформуле:ТРО = (V в контроле – V в опыте) / V в контроле × 100%50Выживаемость животных вычисляли как отношение количестваумерших животных к живым животным, выраженное в процентах.Интегральный показатель – увеличение продолжительности жизни (УПЖ).Изучениевлиянияβ-гептилгликозидаМДПнадинамикупоискового рефлекса и рефлекса вертикальной стойки у мышейОпределение норкового рефлекса и рефлекса вертикальных стоекслужило для количественного измерения изменения функциональнойактивностицентральнойопухолевогопроцесса.нервнойсистемыМоделированиеживотныхмеланомыприиразвитиивведениеβ-гептилгликозида МДП проводили как описано выше.МышейлинииС57Bl/6помещалинаповерхность,имеющуюравномерно распределенные отверстия диаметром в 1 см.

Попытка животногоизучить отверстие расценивалась как проявление норкового рефлекса, апринятие животным вертикального положения служило подтверждениемрефлекса вертикальной стойки. Поведенческие реакции определяли в течение90 секунд на каждое животное у 6 животных, случайно выбранных из каждойгруппы на 10 и 20 сутки после перевивки опухоли.3.

Методы статистической обработки результатовВсе полученные данные были обработаны в программе Statistica 10(StatSoft, США). Статистическую значимость отличий количественныхпоказателейнезависимыхвыборокопределялиспомощьюнепараметрических критериев для парного и множественного сравнения (Uкритерий Манна-Уитни, критерий Краскела-Уолиса, критерий Данна).Статистически значимыми считали отличия при p<0,05.На рисунках количественные данные представлены в виде: среднее,стандартная ошибка среднего, удвоенное стандартное отклонение (mean; SE;SD×2). В таблицах данные представлены как среднее ± стандартноеотклонение.51РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯГлава 1. ИММУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ β-ГЛИКОЗИДОВ МДП САЛИФАТИЧЕСКИМИ, ЦИКЛИЧЕСКИМИ И ТРИЦИКЛИЧЕСКИМИАГЛИКОНАМИ IN VITRO1.1.

Влияние гликозидов МДП на цитотоксическую активностьмононуклеарных лейкоцитов кровиНа первом этапе работы для сравнения биологической активности βгликозидов МДП по отношению к иммунокомпетентным клеткам человека invitro оценили изменение цитотоксической активности NK-клеток приинкубации мононуклеарных лейкоцитов крови с этими соединениями вэквимолярных концентрациях. Немодифицированный МДП использовали вкачестве референс-контроля.Прикоинкубациимононуклеаровсβ-гликозидамиМДПсалифатическими агликонами или референс-контролем в концентрации 1мкмоль/млнеобнаруженостатистическизначимогоизмененияцитотоксической активности клеток (рис.

4).Средигликозидовсциклическимиагликонамитолькоβ-циклооктилгликозид МДП в этой концентрации повышал NK-зависимуюцитотоксичность, а β-адамантилгликозид МДП снижал ее (рис. 4).52*** – р<0,05 в сравнении с контролемРисунок 4. Влияние гликозидов МДП в концентрации 1 мкмоль/мл нацитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов крови поотношению к клеткам линии К562При внесении в культуру мононуклеаров периферической кровинемодифицированного МДП и β-гептилгликозида МДП в концентрации 10мкмоль/мл зафиксировано существенное и примерно одинаковое повышениецитототоксическойактивностивсравнениисконтролем.β-Адамантилгликозид МДП снижал NK-активность лейкоцитов, а другие βгликозиды МДП в этой же концентрации не оказывали значимого влияния наспособность мононуклеаров лизировать NK-чувствительные клетки-мишени(рис.

5).**** – р<0,05 в сравнении с контролемРисунок 5. Влияние гликозидов МДП в концентрации 10 мкмоль/мл нацитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов крови поотношению к клеткам линии К562Среди всех исследованных соединений только немодифицированныйМДП и β-гептилгликозид МДП в концентрации 100 мкмоль/мл статистически54значимо и примерно в равной степени увеличивали NK-активностьмононуклеарных лейкоцитов (рис. 6).Другие гликопептиды в этой дозе не влияли на NK-зависимуюцитотоксичность мононуклеаров (рис. 6).*** – р<0,05 в сравнении с контролемРисунок 6. Влияние гликозидов МДП в концентрации 100 мкмоль/мл нацитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов крови поотношению к клеткам линии К562ВызванныйМДПиβ-гептилгликозидомМДПцитолизNK-чувствительных клеток мононуклеарами периферической крови коррелировалс усилением контактов клеток-эффекторов и клеток-мишеней.В контрольных лунках мононуклеарные лейкоциты и клетки линии К562при инкубации в среде без добавления мурамипептидов образовывали в полезрения лишь единичные конгломераты, состоящие из 3-5 клеток (рис.

7А).55Рисунок 7. Образование конгломератов мононуклеарных лейкоцитовпериферической крови и клеток К562Инвертированный микроскоп. Фазовое контрастирование Ув. ×400.А – Единичные конгломераты мононуклеарных лейкоцитов и клеток линииК562(контроль).Б–Образованиеконгломератовмононуклеарныхлейкоцитов и клеток линии К562 при инкубации с МДП. В – Образованиекрупных конгломератов мононуклеарных лейкоцитов и клеток линии К562,инкубированных с β-гептилгликозидом МДП.Добавление в культуральную среду МДП или β-гептилгликозида МДП вконцентрации10мкмоль/млвызывалообразованиемногочисленныхконгломератов клеток-эффекторов и клеток-мишеней, состоящих из 3-10клеток (рис.

7Б и 7В).Таким образом, внесение в культуру мононуклеарных лейкоцитовнемодифицированного МДП и его гликозидных аналогов по-разному влияло56на цитотоксическую активность этих клеток по отношению к NKчувствительной линии К562.β-ГептилгликозидстимулирующийМДПэффект,оказывалвыраженныйсопоставимыйсдозозависимыйтаковымреференс-иммуностимулятора.Коинкубацияклеток-эффекторовсдецилгликозидомМДПициклооктилгликозидом МДП вызывала лишь тенденцию к повышениюцитотоксической активности клеток-эффекторов при применении в дозе 100мкмоль/мл.Додецилгликозид МДП в дозе 10 мкмоль/мл и β-адамантилгликозидМДП дозах 1 и 10 мкмоль/мл статистически значимо снижали NK-активностьмононуклеаров.1.2.

Влияние гликозидов МДП на фагоцитарную активностьнейтрофилов кровиНа втором этапе исследования оценили способность нейтрофиловцельной крови к фагоцитозу гранул латекса после инкубации с β-гликозидамиМДП в концентрации 10 мкмоль/мл и МДП в такой же концентрации вкачестве референс-контроля.Из исследуемых соединений только β-гептилгликозид МДП вызывалповышение фагоцитарного индекса в сопоставимой степени с референспрепаратом. В остальных случаях отличия от контроля отсутствовали (рис. 8).57*** – р<0,05 в сравнении с контролемРисунок 8. Фагоцитарный индекс нейтрофилов крови,инкубированных с гликозидами МДПФагоцитарноечислонейтрофиловкровиздоровыхдоноровстатистически значимо не изменялось в ответ на воздействие тестируемыхвеществ в концентрации 10 мкмоль/мл.

Вместе с тем следует отметитьтенденцию к повышению фагоцитарного числа при внесении в культуральнуюсреду немодифицированного МДП, а также тренд к снижению этогопоказателяприиспользованиициклодецилгликозида МДП (рис. 9)β-адамантилгликозидаиβ-58Рисунок 9. Фагоцитарное число нейтрофилов крови, инкубированныхс гликозидами МДПТаким образом, из исследованных гликозидов МДП, только βгептигликозид МДП обладал математически подтвержденной способностьюувеличивать фагоцитарную активность (фагоцитарный индекс) нейтрофиловцельной крови.Данные первых двух блоков работы, представленных в разделах 1.1.

и1.2. позволили отобрать β-гептилгликозид МДП как наиболее перспективноесоединение для дальнейших углубленных исследований.591.3. Влияние МДП и β-гептилгликозида МДП на экспрессию маркеровактивации дендритными клетками, полученными из крови здоровыхдоноровВ данном разделе рассмотрено влияние β-гептилгликозида МДП наэкспрессию ДК человека мембраноассоциированных молекул, связанных ссозреванием этих клеток.Было определено количество и соотношение CD1a+, CD40+, CD80+,HLA+, CD86+, CD14+, СD83+ клеток в общей популяции ДК, инкубированныхс β-гептилгликозидом МДП в концентрации 10 мкмоль/мл в течение 48 часов.В качестве референс-контроля использовали показатели экспрессии этихмолекул ДК, подвергнутыми инкубации с немодифицированным МДП в тойже концентрации.При культивировании ДК в среде с добавлением МДП или βгептигликозидом МДП отмечалось формирование конгломератов CD14+клеток (рис.

10).Оба мурамилпептида увеличивали количество CD14+-клеток в общейклеточной популяции (табл. 3; рис. 10).В то же время МДП и β-гептилгликозид МДП не вызывалистатистически значимых изменений экспрессии клетками других изучаемыхмаркеров (табл. 3; рис. 11-16).60Иммунофлюоресценция (антитела кCD14, меченные FITC).Инвертированный микроскоп, сподсветкой УФ излучением. Ув.×400.A – Культура клеток, выделенныхиз крови здорового донора(контроль).Б – Конгломераты CD14+-клеток вкультуре мононуклеарныхлейкоцитов, инкубированных сМДП.В – Крупные конгломераты CD14+клеток в культуре мононуклеарныхлейкоцитов, инкубированных с βгептилгликозидом МДП.Рисунок 10. CD14+-клетки в культуре ДК, подвергнутых воздействиюМДП или β-гептилгликозида МДП61Иммунофлюоресценция (антителак CD80, меченные FITC).Инвертированный микроскоп, сподсветкой УФ излучением.