Диссертация (Влияние структуры агликона на иммунотропную активность гликозидов мурамилдипептида)

Федеральное государственное бюджетное научное учреждениеНаучно-исследовательский институт морфологии человекаНа правах рукописиХочанский Андрей НиколаевичВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ АГЛИКОНА НА ИММУНОТРОПНУЮАКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИДОВ МУРАМИЛДИПЕПТИДА14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергологияДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучные руководители:доктор медицинских наук, профессорКалюжин О.В.доктор медицинских наук, профессорКиселевский М.В.Москва – 20182ОГЛАВЛЕНИЕстр.ОГЛАВЛЕНИЕ2ВВЕДЕНИЕ4ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ11Глава 1. ИММУНОТЕРАПИЯ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХЗАБОЛЕВАНИЯХ121.1.

Коррекция состава микробиоты121.2. Модуляция адаптивного иммунного ответа141.3. Модуляция врожденного иммунитета18Глава 2. ИММУНОТЕРАПИЯ ПРИ НОВООБРАЗОВАНИЯХ20Глава 3. МУРАМИЛПЕПТИДЫ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕИММУНОМОДУЛЯТОРЫ ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ243.1.

Мурамилдипептид: общая характеристика, история изучения243.2. Механизмы иммунотропной активности мурамилпептидов263.3. Модификация структуры МДП в рамках поиска эффективных ибезопасных иммуномодуляторов283.3.1. Липофильные производные МДП283.3.2. Производные МДП с модифицированным пептидом293.3.3. Полимурамил как активатор рецепторов NOD1 и NOD2.313.3.4.

Влияние модификации сахаридной части мурамилпептидов на ихиммунотропную активность323.3.5. Влияние модификаций агликона на иммунотропную активность Огликозидов МДП343.3.6. Амфифильность β-гликозидов МДП как фактор повышения ихбиологической активности.35МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ38Материально-техническое обеспечение работы38Методы экспериментальных исследований42Методы статистической обработки результатов503РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ51Глава 1. ИММУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИДОВ МДП САЛИФАТИЧЕСКИМИ, ЦИКЛИЧЕСКИМИ И ТРИЦИКЛИЧЕСКИМИАГЛИКОНАМИ IN VITRO511.1.

Влияние гликозидов МДП на цитотоксическую активностьмононуклеарных лейкоцитов крови511.2. Влияние гликозидов МДП на фагоцитарную активность нейтрофиловкрови561.3. Влияние МДП и β-гептилгликозида МДП на экспрессию маркеровактивации дендритными клетками, полученнымииз крови здоровых доноров59Глава 2. ИММУНОТРОПНАЯ, ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ ИНЕЙРОФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯАКТИВНОСТЬ β-ГЕПТИЛГЛИКОЗИДА МДП IN VIVO692.1. Изменение концентрации цитокинов в сыворотке крови мышейC57BL/6 после внутрибрюшинного введения МДП илиβ-гептилгликозида МДП692.2. Действие β-гептилгликозида МДП на рост меланомы B16 ипродолжительность жизни мышей-опухоленосителей972.3.

Влияние β-гептилгликозида МДП на динамику поисковогои норкового рефлексову мышей C57BL/6 с привитой меланомой B16104ЗАКЛЮЧЕНИЕ107ВЫВОДЫ116ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ117СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ118СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ1194ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемыНесмотря на успехи в этиотропной терапии инфекционных заболеваний,сегодня общая смертность от них остается на высоком уровне. В развитыхстранах инфекционные болезни занимают 4-е место среди причин смерти, в товремя как в некоторых развивающихся странах они остаются главнойпричиной летальности населения [28, 149].Следствиемвозникновениечрезмерногоинфекционныхпримененияагентов,антибиотиковобладающихявилосьмножественнойлекарственной устойчивостью [44]. Клинической проблемой становитсяразвитие среди патогенов устойчивости к антибиотикам резервного ряда.Достаточно часто возбудители инфекционных заболеваний резистентны кподавляющему большинству антибиотиков [225, 61].

В связи с этимэтиотропная терапия во многих аспектах зашла в тупик.Также становится все более актуальной проблема повышения частотыразвития опухолевых процессов, приводящих к увеличению смертности иинвалидизации населения. Традиционная химиотерапия характеризуетсявысокой стоимостью и обладает множеством побочных эффектов, в том числеиммуносупрессивным действием. Опухолевые заболевания становятся всёболее распространенными среди населения всех возрастных групп, что ставитновые вызовы перед современными протоколами химиотерапии [208].Финансовая нагрузка на здравоохранение, вызванная необходимостьюдолговременной поддержки таких больных, в некоторых случаях сравнима идажепревосходиттаковуюубольныхссердечно-сосудистымизаболеваниями.В этой ситуации не теряют своей актуальности дополнительные методыи средства, способные повысить эффективность терапии указанных группзаболеваний.

Одним из подобных направлений стала иммунотерапия,обладающая рядом преимуществ перед традиционным этиотропным лечениемкак инфекционных, так и неопластических болезней [20, 24, 29].5Перспективнойгруппоймультифункциональныхиммунотропныхсоединений являются лиганды NOD-подобных рецепторов (NLR), активациякоторых способна не только усиливать экспрессию провоспалительныхцитокинов иммунокомпетентными клетками, но и блокировать флогогенныебиохимические реакции [10].

Пожалуй, наиболее изученным NOD-лигандом,а именно агонистом цитоплазматических рецепторов NOD2, являетсямономер пептидогликана клеточной стенки бактерий N-ацетилмурамил-Lаланил-D-изоглутамин, или мурамилдипептид (МДП). Созданы различныемодификации МДП, некоторые из которых уже нашли клиническоеприменение в качестве иммуномодуляторов широкого спектра действия [1, 25,31].

Рациональным подходом к увеличению биологической активности МДПявляется β-гликозилирование [3, 13, 15]. β-Гликозиды МДП обладаютшироким спектром иммунотропного действия и при этом характеризуютсяотносительной легкостью синтеза [4].Степень разработанности темыНесмотря на достаточно большое количество работ по изучениюмеханизмов иммуномодулирующих эффектов гликозидных производныхМДП, остается не до конца решенным вопрос о влиянии структуры агликонана иммунотропную активность гликозидов МДП [8]. Ранее определеновлияниенекоторыхβ-гликозидовМДПнапродукциюпро-ипротивовоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками in vitroи ex vivo [21]. Однако динамика концентрации этих цитокинов в сывороткекровиэкспериментальныхживотныхпослевведенияэтихиммуностимуляторов остается неизученной.

Большая часть доклиническихисследований биологической активности β-гликозидов МДП проведена намышиных моделях in vitro и in vivo. Учитывая наличие существенных отличиймежду иммунным ответому лабораторныхпредставляетсяопределениесинтезированныхактуальнымβ-гликозидовМДПживотныхвлияниянаивновьфункциючеловека,иранеечеловеческихиммунокомпетентных клеток. Открыт и вопрос о влиянии гликозидов МДП на6морфологические характеристики и иммунофенотип дендритных клетокчеловека.Некоторыеиспользуютсявмурамилпептидыкачестве(мифамуртид,компонентовромуртид)комплексноголеченияужерядаопухолевых заболеваний. Вместе с тем среди практикующих врачей и ученыхдостаточно распространено мнение о возможном ускорении роста опухолейпри использовании иммуностимуляторов.

Влияние некоторых гликозидовМДП на рост и метастазирование опухолей in vivo уже было предметомисследования [7, 13], однако выраженность противоопухолевых эффектов идинамика опухолевого роста на фоне применения этих гликопептидовтребуют уточнения.Остается неизученной нейротропная активность гликозидов МДП.Цель исследования – определить влияние структуры агликона наиммуномодулирующеедействиеβ-гликозидовмурамилдипептидадлядальнейшего детального изучения иммунотропной и противоопухолевойэффективности наиболее активного соединения.Задачи исследования:1) Провести сравнительное изучение влияния МДП и семи β-гликозидовМДП с алифатическими (β-гептил-, β-децил-, β-додецилгликозиды МДП),циклическими (β-циклогексил-, β-циклооктил- и β-циклодецилгликозидыМДП) и трициклическим (β-адамантилгликозид МДП) агликонами, нацитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферическойкрови человека.2) Изучить влияние МДП и его семи β-гликозидов на фагоцитарнуюактивность нейтрофилов периферической крови человека.3) Сравнить влияние МДП и наиболее эффективного иммуномодулятораиз изученных β-гликозидов МДП на экспрессию маркеров активации исозревания дендритными клетками человека.4)Сравнитьдинамикуконцентрациипровоспалительныхипротивовоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей линии C57BL/67после внутрибрюшинного введения МДП и наиболее биологически активногоβ-гликозида МДП.5) Оценить влияние наиболее эффективного иммуномодулятора изизученных β-гликозидов МДП на динамику роста и метастазированиемеланомы B16, а также продолжительность жизни мышей-опухоленосителей.6) Изучить влияние наиболее биологически активного β-гликозида МДПна показатели активности ЦНС мышей линии C57Bl/6 с привитой меланомойB16.Научная новизна исследованияВпервые определено влияние структуры агликона на иммунотропнуюактивность семи β-гликозидов МДП по отношению к мононуклеарнымлейкоцитам и нейтрофилам периферической крови человека.Впервые изучено действие β-гептилгликозида МДП на экспрессиюдендритными клетками человека маркеров, ассоциированных со стимуляциейклеточного иммунитета и презентацией антигена.Впервыеопределенадинамикаконцентрациипро-ипротивовоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей послевнутрибрюшинного введения β-гептилгликозида МДП.Впервые оценено действие β-гептилгликозида МДП на функцию ЦНС уэкспериментальных животных-опухоленосителей.Теоретическая и практическая значимость работыДанные об иммунотропной активности новых гликозидов МДП могутслужитьфундаментомдляразработкибезопасныхидейственныхиммуномодулирующих препаратов.

Результаты изучения влияния строенияагликонов на биологические свойства этих гликопептидов предопределяютрациональныенаправлениядлядальнейшегопоискановыхвысокоэффективных производных МДП. Гликозиды МДП могут найтиприменениевклиническойпрактикеинфекционистов,клиническихиммунологов и онкологов. Наиболее вероятными сферами использованияданных препаратов представляются профилактика острых и рецидивов8хроническихинфекционныхэтиотропноголечениязаболеваний,этихболезней,повышениеэффективностиадъювантнаяиммунотерапиязлокачественных новообразований и коррекция вызванных химиотерапиейиммунных и гематологических расстройств у онкологических пациентов.Основные положения, выносимые на защиту1) β-Гликозиды МДП с алифатическими агликонами обладают большейбиологическойактивностьювсравнениис β-гликозидамиМДПсциклическими и трициклическим агликонами; при этом увеличение числаатомов углерода с 7 до 12 в алифатической цепи агликона приводит кснижению иммунотропной действенности соединений в условиях моделей invitro.2)β-ГептилгликозидМДПпревышаетпоиммунотропнойэффективности другие изученные гликозиды МДП и при этом обладаетсходной с немодифицированным МДП биологической активностью поотношению к мононуклеарным лейкоцитам и нейтрофилам крови человека invitro.3) β-Гептилгликозид МДП увеличивает экспрессию молекул CD14дендритными клетками человека in vitro.4) Внутрибрюшинное введение β-гептилгликозида МДП повышаетконцентрацию провоспалительных и регуляторных цитокинов в сывороткекрови мышей линии C57Bl/6, при этом в большинстве случаев βгептилгликозидМДПпревосходитМДПпоцитокин-индуцирующейактивности.5) β-Гептилгликозид МДП при применении в терапевтическом режимеподавляет рост подкожного узла привитой меланомы B16 и повышаетпродолжительность жизни мышей-опухоленосителей.Соответствие диссертации паспорту научной специальностиДиссертация отвечает критериям формулы специальности 14.03.09 –Клиническаясоответствуютиммунология,разделуаллергология.«РазработкаиПроведенноеисследованиеусовершенствованиеметодов9диагностики,леченияипрофилактикиаллергическихииммунопатологических процессов» области исследования, указанной впаспорте этой специальности.Методология и методы исследованияМетоды исследования включали в себя колориметрическое определениецитотоксической активности NK-клеток, измерение фагоцитарной активностинейтрофилов и их фагоцитарного числа по отношению к частицам латекса.Определение экспрессии маркеров активации (CD1а, CD40, CD80,CD83, CD86, CD14, HLA-DR) дендритными клетками человека методомпроточной цитометрии.Измерение уровня цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNFa, GM-CSF, IL-4) в сыворотке крови мышей линии C57BL/6 при помощисистемы FlowCytomix на проточном цитометре.Определение линейного объема опухоли у животных с опухолью B16,определение активности ЦНС у животных путем оценки норкового ипоискового рефлексов.Математическая обработка данных была проведена с помощьюпрограммы Statistica 10 (StatSoft, США).