Диссертация (Разработка фармакопейных стандартных образцов для лекарственных средств пептидной структуры), страница 13

соответственно, а протон CH-11 – мультиплетом при 4.43 м.д.Синглеты при 7.12 м.д. (сигнал сливается с вышеупомянутыми мультиплетамиCH-групп 6 – 8, 25 – 29) и 7.42 м.д. отвечают NH2-группе 13. Сигналы NHфрагментов 14 и 17 соответственно регистрируются в виде дублета при 7.90 м.д. итриплета при 8.00 м.д.. Гексановые CH2-группы 19 и 23 (сигнал частичносливается с сигналом CH3-групп диметилсульфоксида) дают триплетные сдвигипри 2.07 и 2.52 м.д., группы 20, 22 дают мультиплет при 1.47 м.д., а CH2-21 –мультиплет при 1.22 м.д.Навторомэтапепроведенииисследованийбылипроведеныпредварительные компьютерные расчеты спектров ЯМР 13С ГБ-115 (рис.

18А), азатем получены реальные спектры (рис. 18Б) на примере одной субстанции изкаждой серии, после чего проведено точное отнесение сигналов. Постороннихсигналов (кроме сигналов ДМСО в интервале 38 – 41 м.д.) на полученныхспектрах не обнаружено.Индольный структурный компонент на спектре ЯМР 13С субстанции ГБ-115(рис. 5Б) дает характерные сигналы в интервале 109 – 137 м.д.: 123.41 м.д. (CH-2),110.07 м.д.

(С-3), 127.36 м.д. (С-4), 118.17 м.д. (СН-5), 118.33 м.д. (СН-6), 120.7498м.д. (СН-7), 111.18 м.д. (СН-8), 136.01 м.д. (С-9). Сигналы при 27.61, 42.15 и 53.14м.д. отвечают CH2-10, CH2-16 и CH-11. Кето-группы 12, 15 и 18 резонируют всильном поле при 173.26, 168.72 и 172.61 м.д. соответственно. Атомы углеродаалкильной цепи резонируют в слабом поле в узком диапазоне 24 – 36 м.д.: 34.96м.д. (СН2-19), 24.92 м.д. (СН2-20), 28.24 м.д. (СН2-21), 30.65 м.д. (СН2-22), 35.04(СН2-23).

Бензольное кольцо дает два высокоинтенсивных близко расположенныхсигнала при 128.11 м.д. (CH-25, CH-29) и 128.17 м.д. (CH-26, CH-28), а также дваменее интенсивных сигнала при 141.21 и 125.49 м.д., отвечающих С-24 и СН-27.Рисунок 16. Спектры ЯМР 1Н ГБ-115 в DMSO-d6. А – рассчитанный спектр, Бполученный99Рисунок 17. Структурная формула ГБ-115 (нумерация последовательная)А100Рисунок 18. Спектры ЯМР 13С ГБ-115 в DMSO-d6. А – рассчитанный, Б –полученныйТаким образом представленные типичные спектры и их описание дляисследуемых стандартных образцов необходимы для включения в нормативнуюдокументацию в раздел «Подлинность».

Полученный спектр ЯМР13С ГБ-115должен советовать рисунку и сигналам, представленным в нормативнойдокументации.4.3. Хроматографические методы для контроля качества стандартныхобразцов ГБ-115Хроматографическая подвижность и чистота полученных стандартныхобразцов ГБ-115, исходных и промежуточных продуктов синтеза была изучена спомощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определениеостаточных органических растворителей в стандартных образцах проведенометодом газо-жидкостной хроматографии.1014.3.1.

Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализеобразцов ГБ-115Согласно литературным данным поглощение примесей и ГБ-115 в областидлин волн от 200 нм до 230 нм выше, чем в интервале от 250 нм до 300 нм (рис. 1314) [43]. Кроме того, в диапазоне длин волн 200-230 нм наблюдается совпадениемаксимумовпоглощенияГБ-115ипримесей,поэтомудетектированиепосторонних примесей было решено проводить при длине волны 215 нм.В оценке посторонних примесей была использована описанная ранееметодика, разработанная сотрудниками ФГБНУ «Научно-исследовательскийинститут фармакологии им.

В.В. Закусова» [43].Получают не менее пяти хроматограмм каждого из растворов. На рис. 18представленатипичнаяхроматограммаиспытуемыхстандартныхобразцов.Рисунок 18. Типичная ВЭЖХ-хроматограмма стандартного образца ГБ-115Рисунок 19. ВЭЖХ-хроматограмма модельной смеси примесей в системеацетонитрил: вода с рН=3,15 (400: 450), длина волны детектора – 215 нм (1 – ТХ,2 – ФГГ, 3 – ФГК, 4 – ГБ-111102СелективностьТаблица 24Результаты валилации по показателю «Селективность»ДлинаСкоростьволныпотокадетектора подвижнойфазы,мл/минСреднее процентное содержание Среднееаналита в испытуемом растворе, от значениезаданного количества[%]2100,997,51,199,40,998,31,1100,122098,4599,20На хроматограммах, полученных при введении образца подвижной фазы,отсутствуют пики с временами удерживания, соответствующими ГБ-115 ивозможным примесям, что говорит о селективности метода.Средняя величина x98,45Стандартное отклонение sx1,153Относительное стандартное отклонениеsxrel1,167УстойчивостьУстойчивость, или робастность, системы испытывали при незначительномизменении параметров методики количественного определения.

В данном случаеМеняли длину волны детектора и скорость потока подвижной фазы.Критерии допуска коэффициент вариации ≤3% выполнен. Устойчивостьметода удовлетворительная.1034.3.2. Газо-жидкостная хроматография в анализе стандартных образцовГБ-115Стандартные образцы ГБ-115 получают путем кристаллизации из этиловогоспирта при соотношении 1,6-1,7 с обработкой активированным углем. Такимобразом этот растворитель может присутствовать в фармакопейной субстанцииГБ-115 и его необходимо контролировать в разрабатываемых стандартныхобразцах.Намиостаточныхразработанагазохроматографическаяорганическихрастворителейсметодикаопределенияприменениемстатическогопарофазного метода ГХ- HS на газовом хроматографе, снабженным HSустройством для отбора проб (дозатором равновесного пара). В таблице № 25представлены условия хроматографирования, в таблице № 26 параметрыстатического пробоотборника-HS.Таблица 25Хроматографические условия проведения анализа стандартных образцов ГБ-115ДетекторПламенно-ионизационный детектор (ПИД).Температура230 оСдетектораТемпература210оСинжектораТемператураНачальная температура 40оС в течение 4 мин., затемтермостата колонки в повышение температуры со скоростью 15оС/мин.

дорежиме200оС и удерживается в течение 5 мин.программированияГаз носитель (азот)Скорость потока 4,9 мл/мин.Сплит-системаДеление потока 1:5104ВодородСкорость потока - 30 мл/мин.ВоздухСкорость потока - 300 мл/мин.Таблица 26Параметры статического парофазного пробоотборникаТемпература head space виалы85 оСВремя термостатирования (уравновешивания) head 40 мин.space виалыТемпература линии переноса135 оСHS-давление (давление наддува виалы)0,7 МпаВремя нагнетания (подачи под давлением)5 мин.Время отбора пробы10 секОбъём вводимой дозы равновесного пара1 ,0 млМетодика проведения анализа.Для оценки содержания остаточного этанола в стандартных образцах ГБ115 предложен метод внутреннего стандарта. Внутренним стандартом былвыбран н-пропиловый спирт, раствором сравнения – диметилсульфоксид.I. Приготовление стандартных и испытуемых растворов.1.

Приготовление раствора внутреннего стандарта: в мерную колбувместимостью 100 мл отмеривали 20 мл диметилсульфоксида, далее вовзвешенную колбу помещали около 0,5 г (точная навеска) н-пропилового спирта,доводили объем раствора в колбе диметилсульфоксидом до метки, перемешивали105(раствор А). 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбувместимостью 10 мл, доводили объем раствора в колбе до метки тем жерастворителем, перемешивали (раствор Б). Концентрация раствора внутреннегостандарта 0,5 мг/мл.2.Приготовление раствора для определения поправочного коэффициента(раствор В): около 0,5 г (точная навеска) этанола и около 0,5 г (точная навеска)н-пропиловогоспирта помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл,наполненную наполовину диметилсульфоксидом, доводили объем раствора вколбе до метки тем же растворителем, перемешивали. 1 мл полученного растворапереносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили объем раствора вколбе до метки тем же растворителем, перемешивали.

Концентрации обоихвеществ в растворе 0,5 мг/мл.3.Приготовлениерастворадляпроверкипригодностихроматографической системы (раствор С): около 0,05 г (точная навеска) этанолаи около 0,05 г (точная навеска) н-пропилового спирта помещали в мерную колбувместимостью100мл,наполненнуюнаполовинудиметилсульфоксидом,доводили объем раствора в колбе до метки тем же растворителем, перемешивали.1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл,доводили объем раствора до метки тем же растворителем, перемешивали.Концентрации обоих веществ в растворе 0,05 мг/мл.4.

Контрольный раствор: 2,0 мл диметилсульфоксида помещали в headspace виалу вместимостью 10 мл, герметично закупоривают крышками стефлоновыми прокладками и обжимают горловины виал алюминиевымикрышками.5. Приготовление испытуемых растворов стандартных образцов ГБ-115:около 0,2 (точная навеска) субстанции, предназначенной для получениястандартного образца,помещали в виалы для парофазной экстракции,прибавляли 2 мл раствора Б, перемешивали.Растворы используют свежеприготовленными.106II. Проверка пригодности хроматографической системы.В автоматическом режиме в указанных условиях (Таблицы № 18-19) вдозатор хроматографа вводится парогазовая фаза раствора С (раствора дляпроверки пригодности хорматографической системы) в объеме 1,0 см3. Раствор Схроматографируют последовательно в 6 повторностях. На хроматограммахрегистрируют пики этанола и н-пропанола.

Результаты определения считаютсядействительными, если выполняются требования теста «Проверка пригодностихроматографической системы»:- порядок выхода пиков растворителей:1- этанол; 2- н- пропанол; 3- диметилсульфоксид.- эффективность колонки, рассчитанная по пику этанола, должна быть не менее5 000 теоретических тарелок;- разрешение между пиками этанола и н-пропанола должно быть не менее 2,0;- коэффициент асимметрии каждого пика должен быть не более 1,5;- относительное стандартное отклонение площади пика этанола (RSD)- не более10,0%.На рис. 20 представлена типичная хроматограмма раствора ППХС соследующими параметрами:- время выхода пика этанола- 3,046 мин.;- время выхода пика н-пропанола - 5,203 мин.;- относительное время выхода этилацетата – 0,62;- разрешение (n, n+1) – 12,53;- асимметрия пика этанола - 1,04;- число теоретических тарелок по пику этанола (ТТ) – 5320;- относительное стандартное отклонение9,13%.по площади пика этилацетата (RSD)-107Рисунок 20.

Типичная ГЖХ-хроматограмма раствора для проверки пригодностихроматографической системы(1- этанол; 2- н- пропанол)Относительное стандартное отклонение площадей пика этанола (RSD) по 6последовательнымвведениямрастворадляпроверкипригодностихроматографической системы рассчитывали с помощью программы Excel поданным, представленным в таблице № 27.108Таблица 27Расчет относительного стандартного отклонения площадей пика этанола (RSD) врастворе для проверки пригодности хроматографической системыФайл хроматограммыПлощадь пика этанола, mV*секZB230955.chw5,16ZB231031.chw4,73ZB231056.chw5,29ZB231138.chw4,87ZB231206.chw4,69ZB231237.chw4,82ZB231315.chw4,51Среднеезначениеплощадипика4,87Дисперсия0,074Стандартное отклонение0,445Относительноестандартное(RSD), %отклонение9,13%После проведения процедуры проверки пригодности хроматографическойсистемы в описанных выше хроматографических условиях последовательнохроматографируют контрольный раствор, испытуемый раствор и стандартныйраствор В.