Диссертация (Разработка фармакопейных стандартных образцов для лекарственных средств пептидной структуры), страница 9

Полученные УФ-спектры 0,01% и 0,001%спиртовых растворов стандартных образцов должны совпадать с УФ-спектрами,представленными в нормативной документации, должны также определятьсямаксимумы и минимумы поглощения и рассчитываться молярные показателипоглощения.3.2.2. ИК-спектрометрия в анализе стандартного образца ДилептаСпектры исследуемых образцов снимали на ИК-спектрометре Bruker Vertex70(Германия),программноеобеспечениеOPUS5.5.Подготовкупробосуществляли методом прессования анализируемого стандартного образца синертным наполнителем (калия бромидом).ПолученныйтипичныйИК-спектрстандартногообразцаДилептапредставлен на рис.5. Представленный ИК-спектр имеет характеристическиеполосы поглощения, представленные в таблице № 6.Рисунок 5.

Типичный ИК-спектр стандартного образца Дилепта.55Таблица 6Характеристические полосы поглощения ИК-спектра стандартного образцаДилептаДиапазон, см-1Спектральная информация3310ОН-группы, NH-группы1735-COOCH31660,1640,1594-CONH, >N-C=O1519,1432Деформационные колебания С=С связей тирозина822Замещение в кольцеПо положению и интенсивности полос поглощения ИК-спектры всех серийстандартных образцов были практически идентичны, поэтому метод ИКспектрометрии включён в нормативную документацию в раздел «Подлинность»на полученные стандартные образцы. ИК-спектр стандартных образцов долженполностью совпадать с предложенным ИК-спектром в фармакопейной статье.Типичный ИК-спектр стандартного образца Дилепта представлен на рис.5.3.2.3.

ЯМР-спектроскопия в анализе стандартного образца ДилептаСпектры ЯМР регистрировали на приборе Bruker AM300 (300.13 МГц для1H и 75.47 МГц для 13С) в ДМСО-d6 (Acros, Бельгия). В ходе теоретическихрасчетов, обработки и интерпретации спектров использовали компьютерноепрограммное обеспечение ACD Labs [ACD Labs 10 (сборка 18036, версия17.01.2008).Подготовка образцов для регистрации спектров ЯМР 1Н и 13С:Навеску исследуемого стандартного образца Дилепта массой 50 мг растворяли в0,6 мл ДМСО-d6 и помещали в стеклянную ампулу для ЯМР-спектроскопии.56При регистрации спектров ЯМР использовали стандартную одноимпульснуюпоследовательность с последующим Фурье-преобразованием (в случае спектров13Cдополнительноиспользовалиширокополоснуюпротоннуюразвязку).Химические сдвиги ЯМР-сигналов определяли относительно тетраметилсилана.Отнесение сигналов производили на основании теоретических расчетов илитературных данных с учетом интенсивности сигналов и спин-спиновыхвзаимодействий.На следующем этапе исследований для Дилепта в соответствии срасчетными данными (рис.

6 а) и имеющимися литературными описаниямипровелисопоставлениесигналовпохимическимсдвигамиформессоответствующими пронумерованными участками молекул (рис. 7). После этогона спектрах ЯМР 1Н, полученных для 3-х серий стандартного образцы (рис. 6 б )найдены аналогичные сигналы. Спектры трех серий стандартного образцапрактически идентичны (форма сигналов была постоянна, а колебания значенийхимических сдвигов не превышало 0.1 – 0.2 м.д.), при этом посторонние сигналы(кроме соответствующих синглетных сигналов диметилсульфоксида и воды при2.52 и 3.35 м.д.) отсутствуют, что дополнительно свидетельствует обиндивидуальности и чистоте полученных стандартных образцов.Дилепт (рис.

7) представляет собой метиловый эфир N-капроил-L-пролилL-тирозина. Субстанция, предназначенная для создания стандартного образца,состоит из 2-х конформеров [4], что приводит к расщеплению спектральныхполос в соотношении ~1:1 (рис. 6, б). Метиленовый фрагмент 1 резонирует в видемультиплетного сигнала в интервале 3.25 – 3.53 м.д., а циклические CH2-2 и СH2-3группы сливаются в трудночитаемый мультиплет с ациклическими CH2-звеньями7 – 10 в области 1.02 – 2.35 м.д. Расщепленный дублетный сигнал при 4.26, 4.35м.д. отвечает группе CH-4 и накладывается на триплет расщепленного сигналагруппы CH-13 тирозинового компонента при 4.36, 4.45 м.д.

Метильная группа 11резонирует двумя триплетами при 0.83, 0.88 м.д., а NH-12 – двумя дублетами при8.09, 8.41 м.д. Мультиплет в диапазоне 2.75 – 3.06 м.д. отвечает CH2-фрагменту5714. Расщепленные и частично накладывающиеся друг на друга мультиплетныесдвиги при 6.98, 7.00 м.д.

отвечают ароматическим протонам 16 и 20, а при 6.64,6.67 м.д. – CH-протонам 17 и 19. Сигналы ОН-группы 22 и OCH3-группы 23 даютрасщепленные синглеты при 9.21, 9.24 м.д. и 3.58, 3.64 м.д. соответственно.В целом, несмотря на информативность спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н ванализе строения Дилепта, интерпретация спектров значительно затруднена из-засложных по форме и накладывающихся друг на друга сигналов.

В этом планеболее эффективной и интерпретируемой представляется один из видов ЯМРспектроскопии на ядрахС, включающий развязку от протонов: подавление13спин-спиновых взаимодействий резонирующих атомов приводит к сигналам ввиде узких полос и это позволяет различить даже очень близко расположенныесигналы. При этом предварительные компьютерные расчеты таких спектровявляются более точными по сравнению с ЯМР 1Н.В соответствии с этим, на втором этапе исследований были проведеныпредварительные компьютерные расчеты спектров ЯМР 13С Дилепта (рис.

8, а), азатем получены их реальные спектры (рис. 8 б) на примере одной субстанции изкаждой серии, после чего проведено точное отнесение сигналов. Постороннихсигналов (кроме сигналов ДМСО в интервале 38 – 41 м.д.) на полученныхспектрах нет.На спектре ЯМР13С Дилепта (рис.

8, б) также имеются расщепленныесигналы атомов углерода, отвечающие двум конформерам. Метиленовая группа 1иCH-группа4пирролидиновогокольцарезонируютввидедвухблизкорасположенных расщепленных линий при 46.19 , 46.62 м.д. и 58.77, 59.45м.д. соответственно, в то время как CH2-2 и CH2-3 проявляются при 25.52 и 29.08м.д. Одиночная полоса при 171.67 м.д. и расщепленный сигнал при 171.80, 171.92м.д. соответствуют кето-группам 5 и 6. Алкильные группы 7 – 11 по мереудаленности от акцепторной кето-группы 6 последовательно регистрируются вформе одиночных или расщепленных пиков при 33.06, 33.51 м.д. (CH2-7), 30.83,30.89 м.д.

(CH2-8), 23.79 м.д. (CH2-9), 21.89, 21.96 м.д. (CH2-10) и 13.73 м.д. (CH3-5811). Группы CH-13 и CH2-14 дают характерные расщепленные линии при 53.26,53.70 м.д. и 35.39, 35.92 м.д. Высокоинтенсивные расщепленные сигналы при114.84, 114.91 м.д. и 129.73, 129.89 м.д. соответствуют ароматическим CHгруппам 17, 19 и 16, 20, а углеродным атомам 15 и 18 отвечают расщепленныепики при 126.87, 127.31 м.д. и 155.90, 155.94 м.д. Атомы углерода сложноэфирнойгруппы резонируют единым сигналом при 170.96 м.д. (CO-21) и расщепленнымсигналом при 51.54, 51.56 м.д.

(OCH3-23).А59БРисунок 6. Спектры ЯМР 1Н Дилепта в DMSO-d6. А – рассчитанный спектр, БполученныйРисунок 7. Структурная формула Дилепта (нумерация последовательная)60АБРисунок 8. Спектры ЯМР 13С Дилепта в DMSO-d6. А – рассчитанный, Б –полученный.61Таким образом представленные типичные спектры ЯМР13С Дилепта и ихописание для исследуемых стандартных образцов необходимы для включения внормативную документацию в раздел «Подлинность».

Полученный спектр ЯМР13С Дилепта должен соответствовать рисунку и сигналам, представленным внормативной документации.3.3. Хроматографические методы в контроле качества стандартныхобразцов ДилептаХроматографическая чистота полученных стандартных образцов Дилепта,былаизученаспомощьюметодоввысокоэффективнойжидкостнойхроматографии.

Определение содержания остаточных органических растворителейв стандартных образцах проведено методом газо-жидкостной хроматографии.3.3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализестандартных образцов ДилептаВ связи с высокими требованиями, предъявляемыми к стандартнымобразцам, а также по ранее полученным данным был выбран метод ВЭЖХ дляанализа чистоты стандартных образцов Дилепта с последующим включением внормативную документацию. [54]В полученных стандартных образцах Дилепта могут присутствоватьисходные продукты синтеза, а именно метиловый эфир L-тирозина и N-капроил-Lпролин. Кроме этого в субстанции Дилепта могут быть обнаружены продуктыгидролиза полученного препарата – N-капроил-L-пролил-L-тирозин.Согласно литературным данным [54] поглощение Дилепта и возможныхпримесей в области от 200 до 210 нм выше, чем в интервале от 250 до 300. Такжесовпадение максимумов поглощения этих соединений наблюдается в интерваледлин волн от 200 до 210 нм, поэтому детектирование проводили при длине волны205 нм.62В оценке посторонних примесей была использована описанная ранееметодика, разработанная сотрудниками ФГБНУ «Научно-исследовательскийинститут фармакологии им.

В.В. Закусова».[54]Хроматографирование раствора проводят не менее пяти раз. На рис. 9представлена типичная ВЭЖХ-хроматограмма испытуемых субстанций.Рисунок 9. Типичная ВЭЖХ-хроматограмма стандартного образца ДилептаРисунок 10. ВЭЖХ-хроматограмма полупродуктов синтеза и гидролизаДилепта (1-метиловый эфир L-тирозина, 2 – N-капроил-L-пролил- L – тирозин, 3 –N- капроил-L-тирозин)63СелективностьНа хроматограммах, полученных при введении образца подвижной фазы,отсутствуют пики с временами удерживания, соответствующими Дилепту ивозможным примесям, что говорит о селективности метода.УстойчивостьУстойчивость, или робастность, системы испытывали при незначительномизменении параметров методики определения посторонних примесей. В данномслучае меняли длину волны детектора и скорость потока подвижной фазы.Таблица 7Результаты валидации по показателю «Устойчивость»ДлинаСкоростьСреднее процентное содержаниеволныпотокааналита в испытуемом растворе, от неедетектораподвижной заданного количестваСредзначениефазы,[%]мл/мин2002100,499,50,699,10,4100,40,6101,199,30100,75Средняя величина x100,03Стандартное отклонение sx0,900Относительноестандартное0,899отклонение sxrelКритерии допуска коэффициент вариации ≤3% выполнен.