Диссертация (1141384), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Используя данные видысорбентов, получают высоко воспроизводимые результаты.Вкачествеподвижнойфазывобращенно-фазовойВЭЖХмогутиспользоваться как индивидуальные растворители, так и их смеси: смеси водаацетонитрил или вода-метанол в чистом виде или с добавлением солейфосфорной, серной или уксусной кислот.Оптимизировать разделения соединений пептидной структуры и подобратьоптимальныеусловияхроматографированияможно,изменяяпараметрыхроматографической системы.Основными критериями для оценки хроматографического разделенияявляются такие показатели, как число теоретических тарелок (N), факторразмывания зоны (T), коэффициент емкости (k’), коэффициент разделения (α),разрешение (Rs) [106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117].Методика определения посторонних примесей в фармакопейных субстанцияхДилепта и ГБ-115 были разработаны и опубликованы ранее.
[43, 54]1.6.4.2. Газо-жидкостная хроматографияМетод ГЖХ обладает рядом достоинств, к которым можно отнестивысокуючувствительностьиселективностьметода,высокуюскорость40проведения анализа, возможность использовать различные типы детекторов(пламенно-ионизационный, азотный или фосфорный детектор, детектор захватаэлектронов и масс-спектрометр).Препараты пептидной структуры – высокополярные соединения с низкойлетучестью, что требует проведения дериватизации для увеличения летучестиданных соединений. Сложные процессы дериватизации, необходимые для анализапептидных препаратов, исключают этот метод в качестве рутинного. Однакометод ГЖХ является наиболее подходящим для анализа остаточных органическихрастворителей в стандартных образцах [61, 88, 106]. Для фармакопейныхсубстанций исследуемых препаратов были разработаны методики определенияостаточных органических растворителей, однако в НД они не вошли.
[43,54]Кроме того в процессе дальнейших исследований, была показана необходимостьразработкиновыхистандартных образцов.болеечувствительныхметодовконтролякачества41ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования2.1. Объекты исследованияОбъектамиисследованийявлялись3образцасубстанцииГБ-115,промежуточные продукты его синтеза – фенилгексаноилглицин, L-триптофанахлорогидрат, фенилгексановая кислота – исходный продукт синтеза.Также материалами исследований являлись 3 образца субстанции Дилепта,исходные продукты синтеза метиловый эфир L-тирозина и N-капроил-L-пролин, атакже продукт гидролиза полученного препарата – N-капроил-L-пролил-Lтирозин.Синтез субстанций ГБ-115 и Дилепта осуществлен в отделе химии ФГБНУ«Научно-исследовательскийинститутфармакологииим.В.В.Закусова»(руководитель отдела – доктор биологических наук, профессор, член корреспондент РАМН - Т.А.
Гудашева).Очисткасубстанцийлекарственныхсредствтехнологическогоотделапроизводиласьвгруппехимико-технологическойФГБНУтехнологиисинтезалабораторииопытно-«Научно-исследовательскийинститутфармакологии им. В.В. Закусова» (руководитель группы – кандидат химическихнаук, ведущий научный сотрудник - Авдюнина Н.И.).Исходные и промежуточные продукты синтеза ГБ-115 были предоставленыотделом химии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии им.В.В. Закусова» (руководитель отдела – доктор биологических наук, профессор,член - корреспондент РАМН - Т.А.
Гудашева).2.2.Используемое оборудованиеОценку физико-химических свойств ГБ-115 и Дилепта, разработку ивоспроизведение методик анализа и научно-обоснованных норм качествастандартныхобразцовпроводиливаналитическойгруппехимико-технологической лаборатории опытно-технологического отдела (руководительаналитической группы – д.
фарм. н. Л.Н.Грушевская) и в ИспытательнойлабораторииэкспертизыкачествалекарственныхсредствНаучно-42исследовательского института Фармации ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России (заведующая лабораторией – Санникова ЕленаЮрьевна).Для изучения спектральных характеристик субстанции использовали УФспектрофотометр UV-1700 (“Shimadzu”, Япония), ИК-спектрометр Bruker Vertex70 (Германия), Bruker AM300 (300.13 МГц для 1H и 75.47 МГц для 13С).Определение угла вращения проводили на автоматическом поляриметреADP 410 (Bellingham + Stanley, Великобритания).Температуру плавления определяли на приборе Buchi Melting Point B-540.Определение воды по методу Карла Фишера проводили на приборе MettlerToledo DL 32.Для определения рН растворов pH-метр Mettler Toledo Seven Compact S230.Хроматографический анализ методом ВЭЖХ проводили на жидкостномхроматографе Agilent 1200 Series с колонкой Luna C18(2) 100 A, LC Column 250 х 4.6mm, Ea.
3 мкм).Хроматографический анализ методом газовой хроматографии проводили нахроматографе с пламенно-ионизационным детектором Газовый хроматографCarlo Erba 6000 Vega Series 2 GC (фирмы «Carlo Erba Strumentazione», ИталияКолонка: Капиллярная колонка DB-624 длиной 60 м, внутренним диаметром 0,53мм и фазой, состоящей из 6% -цианпропилфенила и 94%-диметилполисилоксана(толщина пленки 3 мкм).).Изучениетакихпоказателейкак:внешнийвид,растворимость,прозрачность, цветность и рН водных растворов, потеря в массе привысушивании, температура плавления проводили в соответствии с требованиямиГосударственной Фармакопеи XIII издания.Количественное определение ГБ-115 в субстанции методом определенияобщего азота по Къельдалю проводили также в соответствии с требованиямиГосударственной Фармакопеи XIII.Статистическую обработку осуществляли в соответствии с требованиямиГосударственной Фармакопеи XIII.432.3.
Используемые реактивыДляопределениярастворимостиисследуемогосоединениябылииспользованы следующие растворители: вода очищенная, спирт этиловый 95%,ацетон (хч), диэтиловый эфир (чда), этилацетат (чда), диоксан (чда), гексан (хч),хлороформ (хч), толуол (чда).Для хроматографического анализа методом ВЭЖХ были использованыследующие химические вещества и растворители: вода очищенная, ацетонитрил(для ВЭЖХ, для градиентной хроматографии (Biosolve) или «сорт 0» и «сорт 1»(Криохром)), фосфорная кислота (орто) (хч), калия дигидрофосфат (≥99,0%(Sigma) или чда).Для количественного определения методом Къельдаля применяли кислотусерную (хч), селен (99+, Merck), калия сульфат (хч), меди сульфат пятиводный(чда), калия гидроксид (хч), кислоту борную (хч), кислоту хлористоводородную(хч), метиловый красный (чда), метиленовый синий (чда).2.4.
Используемые ранее разработанные методикиВходеисследованияиспользовалисьранееразработанныеиопубликованные методики определения посторонних примесей и количественносодержания [43, 54].2.4.1. Методики определения посторонних примесей методом ВЭЖХМетодикаопределенияпостороннихпримесейдляфармакопейнойсубстанции Дилепта:Около 0,01 г (точная навеска) препарата помещают в мерную колбувместимостью 100 мл, растворяют в достаточном объеме подвижной фазы,доводят объем раствора подвижной фазы до метки и перемешивают (испытуемыйраствор).4420 мкл (2 мкг) испытуемого раствора хроматографируют в следующихусловиях: C18 5 мкм, длинной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм спредколонкой C18 5 мкм, длиной 30 мм и внутренним диаметром 4,6 мм илианалогичная; подвижная фаза – ацетонитрил-вода-ледяная уксусная кислота(500:500:1), скорость потока подвижной фазы – 0,5 мл/мин, длина волныдетектирования 205 нм, температура колонки комнатная.Перед проведением испытания колонку промывают подвижной фазой доустановления стабильной базовой линии.Методикаопределенияпостороннихпримесейдляфармакопейнойсубстанции ГБ-115:Около 0,025 г (точная навеска) препарата помещают в мерную колбувместимостью 25 мл, растворяют в достаточном объеме подвижной фазы,доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают(испытуемый раствор).По 20 мкл (2 мкг) испытуемого раствора, раствора Б и раствора ППХСхроматографируют в следующих условиях: стальная колонка длиной 250 мм ивнутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом С18 с размером частиц 5мкм (Luna C18(2), 5 мкм (Phenomenex) или аналогичная), подвижная фаза –ацетонитрил – вода, подкисленная до рН 3,15 фосфорной кислотой, (400 - 450),режим элюирования изократический, температура колонки комнатная, скоростьпотока подвижной фазы – 1 мл/мин, длина волны детектирования – 215 нм.Перед проведением испытания колонку промывают подвижной фазой доустановления стабильной базовой линии.Использованные методики были ранее валидированы [43, 54].452.4.2.
Методики определения количественного содержанияВ ходе наших исследований использовались методики количественногоопределения, разработанные ранее [43, 54].Для количественного анализа стандартного образца Дилепта использовалиследующую методику: около 0,2 г Дилепта (точная навеска) минерализуютнагреванием с 7 мл серной кислоты в присутствии катализатора селена вколичестве 0,05 г и 1 г растертой смеси калия сульфата и меди сульфата (всоотношении 10:1) до получения светло-зеленого раствора. Время минерализацииоколо 45 минут. Затем в реакционную среду добавляют избыток (40 мл) 30%раствора натрия гидроксида, и выделившийся аммиак отгоняют в приемник сборной кислотой и смешанным индикатором.
Собирают 100 мл отгона, затемтитруют его стандартным раствором (0,1 моль/л) кислоты хлористоводородной доперехода окраски индикатора от зеленой до красно-фиолетовой. Параллельнопроводят контрольный опыт.Методика проведения определения содержания в стандартном образце ГБ115: анализ, проводят в несколько стадий в приборе для определения азота. Около0,1 г ГБ-115 (точная навеска) в колбе Къельдаля минерализуют нагреванием с 7мл серной кислоты в присутствии смеси катализаторов: 0,075 г металлическогоселена и 1,2 г растертой смеси калия сульфата и меди сульфата (в соотношении10:1) до получения светло-зеленого раствора. Время минерализации около 3часов.Затем колбу подсоединяют к прибору для перегонки и медленно, по каплям,прибавляют избыток (40 мл) 30% щелочи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
