Диссертация (Разработка фармакопейных стандартных образцов для лекарственных средств пептидной структуры), страница 12

В ходенаших исследований не наблюдалось изменений этих показателей, что можетсвидетельствовать о постоянстве состава стандартного образца ГБ-115.4.1.4. Определение температуры плавления стандартного образца ГБ115Определение температуры плавления проводили со скоростью подъематемпературы 0,5-1 °С в минуту по методике ГФ XIII, Том 1 стр. 560.Предварительно высушенные образцы препарата плавились в интервале 177– 179С. Каждый отдельный образец субстанции ГБ-115 плавился в пределах 1-2 Счетко, с видимым разложением. Результаты представлены в таблице № 20.

Дляпроведенияконтролякачествастандартныхобразцовпрепаратабыли89установлены нормы по показателю «Температура плавления», а именно от 177 до179 С0 с разложением. Результаты исследования демонстрируют, что субстанция,предназначенная для создания стандартного образца, более очищенная – пределыпо данному показателю могут быть сужены в отличие от НД для фармакопейнойсубстанции.4.1.5. Определение удельного вращения растворов стандартногообразца ГБ-115Строение молекулы ГБ-115 предполагает наличие у этого вещества двухасимметрических атомов углерода, что в свою очередь обуславливает наличиеоптической активности. Таким образом, было рассчитано удельное вращениерастворов стандартных образцов препарата.

Для определения удельного вращенияиспользовали 5% растворы ГБ-115 в диметилформамиде по методике ГФ XIII,Том 1, стр. 605. Значение удельного вращения растворов ГБ-115 лежало винтервале от -9,00 до -10,00 и норма может быть включена в нормативнуюдокументацию. Полученные результаты определения удельного вращенияпредставлены в таблице № 20.4.1.6. Определение содержания воды в стандартных образцах ГБ-115Определение воды в стандартных образцахГБ-115 проводили согласнометодике ГФ XIII, Том 1, стр. 719.

Содержание воды определяли методомК.Фишера. Результаты представлены в таблице № 20. Включение данногопоказателя в НД на разрабатываемый стандартный образец необходимо, следуясовременнымтребованиямведущихАмериканская и Европейская Фармакопеи.фармакопей,такихкакГФРФ,90Таблица 20Результаты определения температуры плавления, удельного вращения и воды длястандартных образцов ГБ-115№ серииIIIIIIПоказательТемпература плавления177-178Удельное вращение-9,3-9,0-10,0Вода0,05%0,10%0,09%177,5-178,5 177,5-179.04.1.7.

Определение сульфатной золы в стандартных образцах ГБ-115Определение показателя «Сульфатная зола» проводили согласно методикеГФ XIII, том 1, стр. 714. В таблице № 21 представлены полученные результаты.Оценивая полученные результаты, был сделан вывод о необходимостивключения в ФС на разрабатываемый стандартный образец нормы не более 0,1 %,также как и для фармакопейной субстанции.4.1.8. Определение тяжелых металлов в стандартных образцах ГБ-115Определение показателя «Тяжелые металлы» проводили согласно методикеГФ XIII, том 1, стр.

708. Полученные результаты представлены в таблице № 21.Оценивая полученные результаты, был сделан вывод о необходимости включенияв ФС на разрабатываемый стандартный образец нормы не более 0,001 %, такжекак и для фармакопейной субстанции.91Таблица 21Результаты определения сульфатной золы в стандартных образцах ГБ-115№ серииIIIIIIСодержание сульфатной золы0,0450,0670,044Тяжелые металлы0,0010,00090,0014.2. Изучение спектральных характеристик стандартного образца ГБ1154.2.1. УФ-спектрофотометрияИзучив литературные данные, а также исследования, посвященные анализусубстанцииГБ-115,мывыбралиметодикуУФ-спектрофотометрии,дляопределения подлинности полученных стандартных образцов [43].В процессе изучения спектральных свойств, нами получены УФ-спектры0,004 % растворов стандартных образцов препарата в области длин волн от 200 до350 нм. Полученные спектры имели четкие максимумы и минимумы поглощения.На рис.

13-14 представлены типичные спектры стандартных образцов ГБ-115 вэтаноле.92Рисунок 13. Типичный УФ-спектр 0,004% раствора ГБ-115 в этанолеРисунок 14. Типичный УФ-спектр 0,0004 % раствора ГБ-115 в этаноле93Так как для анализа стандартных образцов, в отличие от анализафармакопейной субстанции необходимо введение дополнительных параметровоценки подлинности нами были предприняты попытки установления новых норм,а именно минимумов поглощения. Так как было установлено, что полученныеУФ-спектры 0,004 % растворов ГБ-115 в этаноле имеют характерные максимумыпоглощения при постоянных длинах волн, а именно около 290 нм, 282 нм, в своюочередь полученные УФ-спектры 0,0004 % растворов ГБ-115 имели, кромеописанных выше максимумов, дополнительный максимум при длине волны около219 нм.

Так же были установлены характерные минимумы при длинах волн около287 нм и 245 нм. [43]В таблице № 22 представлены основные спектральные характеристикиспектров поглощения.Таблица 22Основные спектральные характеристики растворов стандартного образца ГБ-115в этаноле (95%)Длина волны, нмОптическаяМолярныйКонцентрацияплотностькоэффициентрастворовпоглощенияМаксимумы290±0,20,50250490,004%282±0,20,5675793219±0,20,41842040,0004%0,004%Минимумы287±0,20,4494516245±0,20,161161994НаличиевполученныхУФ-спектраххарактерныхмаксимумовиминимумов поглощения, а также относительно высокие значения молярныхпоказателей поглощения позволяет использовать метод УФ-спектрофотометриидля определения подлинности стандартных образцов, а также демонстрируетнеобходимость включения данного метода в нормативную документацию наполученные стандартные образцы.

Полученные спектры 0,004% и 0,0004 %спиртовых растворов стандартных образцов должны совпадать со спектрами,представленными в нормативной документации, а также должны такжеопределяться максимумы и минимумы поглощения и рассчитываться молярныепоказатели поглощения.4.2.2. ИК-спектрометрияСпектры исследуемых образцов снимали на ИК-спектрометре Bruker Vertex70(Германия),программноеобеспечениеOPUS5.5.Подготовкупробосуществляли методом прессования анализируемого стандартного образца синертным наполнителем (калия бромидом).ПолученныйтипичныйИК-спектрстандартногообразцаГБ-115представлен на рис. 15. Представленный ИК-спектр имеет характеристическиеполосы поглощения, представленные в таблице №23.95Рисунок 15.

Типичный ИК-спектр стандартного образца ГБ-115Таблица 23Характеристические полосы поглощения ИК-спектра стандартного образца ГБ115Диапазон, см-1Спектральная информация3402свободная NH2-группа3360, 3197ассоциированные NH-группы2927-2852валентные колебания протона в СН-группах1672, 1625валентные колебания С=О амидных карбонилов1505индольный цикл1420, 1350колебания С-N- связей (полоса Амид II)1240, 1201валентные колебания связи С-N в амидах (амид III)738орто-замещение в бензольном кольце697деформационные колебания связи N-H (в RNH2 )96По положению и интенсивности полос поглощения ИК-спектры всех серийстандартных образцов были практически идентичны, поэтому метод ИКспектрометрии включён в нормативную документацию в раздел «Подлинность»на полученные стандартные образцы.

ИК-спектр стандартных образцов долженполностью совпадать с предложенным ИК-спектром в фармакопейной статье.Типичный ИК-спектр стандартного образца ГБ-115 представлен на рис.15.4.2.3. ЯМР-спектроскопияСпектры ЯМР регистрировали на приборе Bruker AM300 (300.13 МГц для1H и 75.47 МГц для 13С) в ДМСО-d6 (Acros, Бельгия). В ходе теоретическихрасчетов, обработки и интерпретации спектров использовали компьютерноепрограммное обеспечение ACD Labs [ACD Labs 10 (сборка 18036, версия17.01.2008).Подготовка образцов для регистрации спектров ЯМР 1Н и 13С:Навеску исследуемого стандартного образца ГБ-115 массой 50 мг растворяли в0,6 мл ДМСО-d6 и помещали в стеклянную ампулу для ЯМР-спектроскопии. ПрирегистрацииспектровЯМРиспользовалистандартнуюодноимпульснуюпоследовательность с последующим Фурье-преобразованием (в случае спектров13Cдополнительноиспользоваласьширокополоснаяпротоннаяразвязка).Химические сдвиги ЯМР-сигналов определяли относительно тетраметилсилана.Отнесение сигналов производили на основании теоретических расчетов илитературных данных с учетом интенсивности сигналов и спин-спиновыхвзаимодействий.В начале исследования в соответствии с расчетными данными (рис.

16А) иимеющимисясигналовполитературными описаниямихимическимсдвигамибыло проведеноформессопоставлениесоответствующимипронумерованными участками молекул (рис. 17). После этого на спектрах ЯМР1Н, полученных для 3-х серий каждой субстанции, предназначенной дляполучения стандартного образца (рис. 16 Б) были найдены аналогичные сигналы.97Во всех случаях спектры разных серий каждого стандартного образца былипрактически идентичны (форма сигналов была постоянна, а колебания значенийхимических сдвигов не превышало 0.1 – 0.2 м.д.), при этом посторонние сигналы(кроме соответствующих синглетных сигналов диметилсульфоксида и воды при2.52 и 3.35 м.д.) отсутствуют, что дополнительно свидетельствуетобиндивидуальности и чистоте полученных стандартных образцов.ЯМР 1Н-спектр ГБ-115 (рис.

17, Б) характеризуется следующими данными:индольные NH-1 и CH-2 протоны дают синглеты при 10.82 и 7.17 м.д. в то времякак группа CH-5 дает хорошо различимый дублет при 7.58 м.д. Остальные CHпротоны (6 – 8) вместе с CH-протонами 25 – 29 бензольного кольца сливаются втрудночитаемые мультиплеты в области 6.83 – 7.38 м.д. Метиленовые звенья 10 и16 проявляются в форме двух дублет-дублетных сигналов при 2.92, 3.13 м.д. и3.54, 3.71 м.д.