Диссертация (Совершенствование методов стандартизации многокомпонентных лечебно-профилактических средств растительного происхождения, применяемых в стоматологии), страница 8

Состав иколичество растительного сырья, необходимое для получения 12,5 г45экстракта жидкого из смеси сырья, входящего в препарат стоматофит Ауказано в таблице 8.Таблица 8Состав растительного сырья, используемого при производстве препаратастоматофит А, в количественном соотношении [18].Название растительного сырьяКора дуба (Cortex Quercus)Цветки ромашки (Flores Chamomillae)Листья шалфея (Folia Salvia)Трава арники (Herba Arnicae)Трава тимьяна обыкновенного(Herba Thymus vulgaris)Трава мяты перечной(Herba Menthae piperitae)Корневища аира (Rhizoma Calami)Количество в граммах1,6251,6251,6250,8120,8120,8120,812Согласно НД [18] препарат стоматофит А представляет собой вязкуюнепрозрачную жидкость темно-коричневого цвета с характерным запахом.Плотность препарата нормирована в диапазоне 0,950-1,050 г/см3, содержаниеспирта 35-45% (о/о), сухой остаток не менее 13% (м/м), тяжелые металлы неболее 0,01%, содержание дубильных веществ в пересчете на пирогаллол неменее 0,12% (м/м), содержание анестезина 1,80-2,20% (м/м)2.2 Приборы, материалы и методики2.2.1 Основные характеристики газового хроматографа «Agilent6890N» с масс-селективным детектором «Agilent 5973N»В настоящем исследовании для анализа объектов исследованияиспользован метод газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ-МС).

Вэксперименте применялся газовый хроматограф “Agilent 6890N” с массселективным детектором “Agilent 5973N” и анализатором паровой фазы“Gerstel MPS 2”. Хроматограф «Agilent 6890N»является основой дляразличных газохроматографических систем и анализаторов [93, 96].46Рис. 1. Газовый хроматограф «Agilent 6890N» [93,96].Термостат для колонок имеет следующие характеристики:- размеры: 28х31х16 см;- рабочая температура: от tºС=(температура окружающей среды+40С) до 4500С;- шаг установки температуры: 1ºС;- максимальная скорость подъема температуры до заданного уровня:1200С/мин;- максимальное время анализа: 999.99 мин;- шестиступенчатый подъем температуры с различными скоростями ивременами изотерм;47- степень подавления влияния окружающей среды: влияние < 0.01ºС на1ºС;- компенсация изменения базовой линии – стандартная для двухканалов.Масс–селективныйдетекторAgilent5973Nпредставляетсобойавтономно управляемый детектор, подключаемый к капиллярной колонкегазового хроматографа.Отличительные особенности масс – селективного детектора:- наличие панели управления, дающей возможность автономного управленияи слежения за работой масс – селективного детектора;- оснащение одним из трех различных насосов, создающих глубокий вакуум- наличие ротационного форвакуумного насоса;- индивидуальный нагрев источника ионов (обслуживающего работу врежиме ионизации электронным ударом);-индивидуальный нагрев устройствасопряжениямасс–селективногодетектора с газовым хроматографом;- возможность пользования химической ионизацией (при работе сположительными или отрицательными ионами) [93, 96].Для проведения исследований были заданы следующие параметры. Способ ионизации – электронный удар 70 эВ; Капиллярная колонка HP FFAP – 60 м и внутренним диаметром 0,32мм; Газ – носитель: гелий – 1,0 мл/мин; Скорость нагрева до температуры 200…20ºС/мин; Ввод пробы осуществлялся с делением газа-носителя (1:10); Температура инжектора и интерфейса составляли 200ºС; Температура колонки 180ºС; Режим снятия масс-спектров (SCAN) в диапазоне 20…280 а.е.м. Объем паровой фазы – 25 мкл.48Масс-спектры идентифицировали с использованием библиотек массспектров.

Масс-спектры, соответствующие вершинам хроматографическихпиков, сравнивали по стандартной методике [96] с масс-спектрами библиотек«NIST08», «Wiley7N», «PMW_TOX3». Полученные масс-спектры БАВобъектов исследования считали идентифицированными при совпадении сбиблиотечными масс-спектрами (коэффициент подобия > 90%).2.2.2.

Анализ равновесной паровой фазыАнализ равновесной паровой фазы имеет ряд преимуществ: исключенытрудоемкие операции пробоподготовки (экстракция, перегонка с водянымпаром), а также перегрузка или загрязнение хроматографической колонкиводой, нелетучими веществами, что неизбежно при непосредственном вводев колонку анализируемой пробы в жидком виде. Эффективность выделениялетучих веществ этим методом составляет 97%, более того, можноидентифицировать вещества на уровне фоновых концентраций в жидких итвердых образцах.Внешний вид анализатора паровой фазы «Gerstel MPS 2» представлен нарисунке 2.Рис. 2. Внешний вид анализатора паровой фазы «Gerstel MPS 2» [93, 96].49Для эффективного анализа объектов исследования использовали методгазовой хроматографии с вводом образцов методом равновесной паровойфазы.

Различают статический и динамический варианты, в нашемисследовании рассматривается динамический вариант введения газовой фазыв хроматограф. Выбор данного метода связан с летучестью основныххимических соединений, входящих в состав объектов исследования. Схемаустройства динамического парофазного анализатора представлена на рисунке3.ДозирующаяпетляТермостатирующийинтерфейсДетекторПЕЧЬХроматографИглаКолонкаРис. 3.

Схема устройства динамического парофазного анализатора [93, 96].Концентрация аналита в газовой и жидкой фазах подчиняется законамГенри, Дальтона и Рауля. Относительное понижение давления насыщенногопара растворителя над раствором не зависит от природы растворенноговещества и равно его молярной доле в растворе:ρ01 − ρ1ρ01гдеρ01=x 2,- давление пара над чистым растворителем при даннойтемпературе,ρ1- давление пара растворителя над раствором,x 2 – молярная доля растворенного вещества.50Чувствительность и точность парофазного метода ограничивается, вчастности, процессом газовой экстракции, который наряду с общимизакономерностями традиционной экстракции имеет ряд особенностей:1.

коэффициент распределения вещества между жидкой и газовой фазойи парциальное давление газа зависят от температуры, что требует строгогособлюдения режима;2. парциальное давление зависит от общего давления в системе;3. высокая чувствительность газохроматографического детектированияпозволяет определять с помощью газовой экстракции даже микропримесилетучих веществ, содержащихся в жидких или твердых объектах, при оченьнезначительной доле извлеченного вещества;4.постояннаятемпературадостигаетсяпривысокойточноститермостатирования в анализируемой системе, что обеспечивает допустимуюпогрешность анализа;5.постояннаятемпература–одинизфакторовповышениячувствительности метода, поэтому для получения точных результатов впроцессе установления фазового равновесия необходимо поддерживатьтемпературу стабильной на уровне десятых долей градуса;6.

время наступления равновесия (от нескольких минут до 1 ч) зависитот температуры и скорости перемешивания фаз;7. при определении веществ, диссоциирующих в растворах, ихионизацией в газовой фазе практически можно пренебречь;8. результаты анализа зависят от состава образца, в том числе от наличияпосторонних ионов в пробе [93].2.2.3 Методика пробоподготовкиГХ-МС анализ с парофазным анализатором исключает трудоемкиепроцедуры пробоподготовки.

Исследуемые образцы в количестве 0,05 млпомещали в виалыобъемом 10 мл для анализа паровой фазы; виалы51термостатировали при 70оС в течение 30 минут; температура микрошприца –70оС [96].2.3 Статистическая обработка и интерпретация результатовисследования. Принципы валидации методики газовой хроматографии/массспектрометрииСтатистическая обработка полученных результатов проводилась всоответствии с требованиямиОФС ГФ XIII «Статистическая обработкарезультатов химического эксперимента» и «Валидация аналитическихметодик», также учитывались методические рекомендации «Руководства повалидации методик анализа лекарственных средств» и пособия «Валидация впроизводстве лекарственных средств» [26, 27, 75].Главнойзадачейвалидациианалитическойметодикиявляетсяэкспериментальное доказательство того, что данная методика пригодна длядостижения тех целей, для которых она предназначена.

Целью валидациианалитической методики является демонстрация ее пригодности дляпредназначенного назначения.Валидация аналитических методик поводится в следующих случаях:разработки новых методов и методик на предприятии и внедрении напредприятии методик, описанных в Фармакопее. Валидация проводится дляследующих, наиболее распространенных, типов аналитических методик:-испытанияпопоказателюкачества«идентификация»(«подлинность») предназначены для подтверждения идентичности аналита вобразце;-методики определения количественного содержания активногодействующего вещества в образцах фармацевтической субстанцииилилекарственного препарата, или других компонентов предназначены дляизмерения содержания аналита в данной пробе.Валидационные характеристики могут различаться в зависимости откатегории проводимого анализа.

В настоящем исследовании для валидации52методики ГХ-МС с целью демонстрации ее пригодности для определениятерпеноидов в многокомпонентных лекарственных препаратах на основеэфирномасличного растительного сырья проведена оценка валидационныххарактеристик,представленныхвтаблице9.Переченьпараметров,подлежащих валидации, был выбран в соответствии с рекомендациями ОФС«Валидация аналитических методик» ГФ XIII и на основе алгоритма выборахарактеристик аналитической методики [8, 9, 27, 75, 74,90, 103, 104, 106, 107,108].Таблица 9.Валидационные характеристики методики газовогохроматографического/масс-спектрометрического анализамногокомпонентных лекарственных препаратов растительногопроисхождения(на примере апробируемых образцовпромышленных серий препарата стоматофит)НаименованиехарактеристикиИспытания наподлинностьКоличественное определение(основное действующеевещество, нормируемыекомпоненты)Специфичность++Линейность-+Прецизионность-+Правильность-+Робастность-+Внастоящемисследованииопределенследующийпереченьхарактеристик, подлежащих проверке:Специфичность.