Диссертация (Функциональная неоднородность нейтрофилов и гормональный дисбаланс у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией), страница 9

По окончании промывки тщательно удаляли остатки жидкости излунок, несколько раз резко вытряхнув планшет о марлевую салфетку илифильтровальную бумагу. Во все лунки планшета вносили по 100 мкл растворасубстрата в той же последовательности, что и конъюгат. Инкубировали планшет притемпературе +37оС в течение 10-15 минут, избегая попадания прямого солнечного света.52Во все лунки планшета вносили по 100 мкл стоп-реагента, перемешивалисодержимое лунок.

С помощью фотометра вертикальногосканирования(Shimadzu Corp., Япония) измеряли оптическую плотность в лунках планшета придлине волны450 нм. Рассчитывалисредние арифметические значенияпоказателей оптической плотности контрольной сыворотки и исследуемыхобразцов и по калибровочному графику определяли концентрацию тестостерона.2.3 Статистическая обработка данныхДля статистической обработки данных применялся пакет прикладныхпрограмм STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., США). Осуществлялся сбор,группировка и поверка первичных данных, удалялись артефакты и техническиедефекты. Осуществлялся контроль нормальности распределения количественныхпризнаков при помощи критериев Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова споправкой Лиллифорса. Метод проверки статистических гипотез об извлечениивыборок из одной генеральной совокупности применялся для контроляоднородности сравниваемых групп.

Проверка однотипности по качественнымпризнакам осуществлялась при помощи анализа таблиц сопряженностей свычислением коэффициента ассоциации Юла и коэффициента контингенцииПирсона. Выполнялась проверка равенства генеральных дисперсий с помощьюкритериев Фишера и Кокрана [11].Для признаков, имеющих распределение отличное от нормального, дляколичественных и категориальных признаков производилось вычисление медиани интерквартильных интервалов.

Интерквартильный размах указывался в виде 25и 75 процентилей: верхней границы 1-го и нижней границы 4-го квартилей.Приводимые данные имеют представление Me (25%; 75%).Для сравнения по одному признаку двух независимых групп использоваликритерии Манна-Уитни, χ2, зависимые группы сравнивались с использованиемкритерия Вилкоксона. Для однофакторного сравнения трех и более независимыхгрупп использовались метод ANOVA по Краскелу-Уоллису.

Непараметрический53дисперсионный анализ трех и более зависимых групп осуществлялся сприменением ANOVA Фридмана.Для изучения взаимосвязи двух признаков использовался корреляционныйанализ по Спирмену. Исследование вида зависимости признака от одного илинескольких других признаков проводилось на основании логистическогорегрессионного анализа.Для определения совокупности признаков, позволяющих различить группыс различным уровнем функциональной активности нейтрофилов, использовалидискриминантный анализ, который осуществлялся в группах больных ССД, СКВи группе контроля. Дискриминантный анализ проводился методом пошаговоговключения с учетом эффекта мультиколлинеарности.

На каждом этаперассматривались все исследуемые переменные и находилась та из них, котораявносит наибольший вклад в различие между группами. Данная переменнаявключалась в модель и происходил переход к следующему шагу.Качественные данные обобщались путем подсчета количества наблюденийкаждой категории, вычисления доли наблюдений конкретной категории висследуемой выборке и выражались в процентах (n (%)).При установлении референсного интервала для количественных признаковиспользовалось процентильное определение нормы, основанное на измерениях,предпринятых на здоровой популяции.Критическое значение уровня статистической значимости принималосьравным 5% [46].54ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1 Функциональная неоднородность нейтрофилов при системной краснойволчанкеОсуществляющие однотипные функции клетки одной популяции могутбыть функционально неравнозначными, различаясь по степени проявлениянеспецифическойактивности,будучиморфологическинеразличимыми.Функциональная неоднородность определяется по различной способностинейтрофилов к генерации активных форм кислорода, взаимодействию ссубстратом, способности к апоптозу, различной степенью экспрессии намембране одинаковых рецепторов или наличием разных рецепторов [20].Для изучения феномена функциональной неоднородности нейтрофилов,определения его взаимосвязи с показателями, характеризующими течение иактивность патологического процесса, а также изменения гормонального статусаприсистемныхзаболеванияхсоединительнойткани,былиопределеныреферентные интервалы изучаемых признаков [46].

Основываясь на определенииреферентных значений показателей функциональной активности нейтрофилов,пациенты были разделены на группы с низким, средним и высоким уровнемкислородзависимоголюминолзависимойметаболизмаклеток.хемилюминесценцииПоказатель(сХЛлл),спонтаннойиспользовавшийсядляопределения коэффициента активации, в таблицах не приводился, так как являлсядифференцирующим фактором для определения референтных значений, делящихпациентов на группы низкой, средней и высокой активности.

Распределениебольных системной красной волчанкой по группам с различной функциональнойактивностью нейтрофилов приведено в таблице 4.55Таблица 4 - Функциональная неоднородность нейтрофилов у больных СКВ взависимости от уровня функциональной активности клеток, Me (Q25–Q75)ПоказательиХЛлл,104,КонтрольIIIIII(n=25)СКВ сСКВ соСКВ снизкимсреднимвысокимуровнемуровнемуровнемФАФАФАнейтро-нейтро-нейтро-филовфиловфилов(n=10)(n=27)(n=13)1,10,61,012,5(0,2-3,0)(0,1-1,3)(1,0-3,2)(1,0-22,8)0,550,351,51,6(0,2-1,1)(0,1-0,5)(0,6-2,8)(1,2-2,5)0,30,1*1,00,9(0,1-0,9)(0,1-0,4)(0,3-1,0)(0,5-1,0)1,691,570,981,36(0,9-3,3)(0,86-(0,29-(0,03-11,0)1,33)1,65)0,750,670,50,4(0,3-1,5)(0,2-2,0)(0,33-(0,25-1,0)0,75)pI-III-IIIII-III0,170,090,080,010,010,610,010,010,620,093 0,120,850,970,370,430,036 0,040,59имп/минсХЛлн,104,имп/миниХЛлн,104,имп/минКА ХЛлл,ЕдКА ХЛлн,ЕдNO3/NO2,мкМ/л3,62,651,5*1,4(3,3-4,1)(1,6-5,0)(0,93-(0,62-2,5)1,85)Примечание:* - p <0,05 по сравнению с контролем56Как следует из представленных в таблице 4 данных, у больных с низкимуровнем активности нейтрофилов наблюдается снижение потенциала образованиясупероксид-аниона, в сравнении с группой контроля, по данным иХЛлн (0,1 (0,10,4)<0,3 (0,1-0,9), р<0,05), у пациентов со средним уровнем биоцидностинейтрофилов регистрировалось уменьшение синтеза оксида азота по даннымNO3/NO2 1,5 (1,6-5,0)<3,6 (3,3-4,1), p<0,05) в сравнении с контрольнымипоказателями.

При межгрупповом сравнении выявлена статистически значимаядифференциация показателей, характеризующих продукцию супероксидногоанион-радикала, по данным сХЛлн в группах с низким и средним и низким ивысокимуровнемкислородзависимогометаболизманейтрофильныхгранулоцитов и потенциал продукции суперксид-аниона по данным иХЛлн вгруппах с низким и средним и низким и высоким уровнем ФА клеток. Уровеньпродукции оксида азота по данным NO3/NO2, так же достоверно различался присравнении групп с низким и средним и низким и высоким уровнем биоцидностиклеток.Функциональная неоднородность нейтрофилов и возраст больныхсистемной красной волчанкойОсновываясь на возрастной классификации ВОЗ, все пациенты висследовании разделены на 2 группы: молодого возраста (до 44 летвключительно) и зрелого возраста (от 45 лет и старше).Былипроведенысравнительныеисследованиякислородзависимогометаболизма нейтрофилов в зависимости от уровня функциональной активностинейтрофилов и возраста пациентов (таблицы 5.1 – 5.3).57Таблица 5.1 - Низкая функциональная активность нейтрофилов и возраст больныхСКВ, Me (Q25–Q75)IpНизкая ФА нейтрофиловПоказательКонтрольАВАВ(n=25)МолодойЗрелыйМолодойЗрелый(n=4)(n=6)1,15,50,35(0,2-3,0)(0,4-11,9)(0,1-0,6)0,890,730,550,350,35(0,2-1,1)(0,2-0,85)(0,2-0,4)0,720,680,30,10,1(0,1-0,9)(0,1-0,25)(0,1-0,45)0,130,521,6917,90,53(0,9-3,3)(1,5-42,9)(0,2-1,2)0,440,170,750,60,66(0,3-1,5)(0,14-1,5)(0,29-1,5)0,080,383,62,52,65(3,3-4,1)(2,0-3,6)(1,6-5,0)0,200,81иХЛлл,104, имп/минсХЛлн,104, имп/миниХЛлн,410 , имп/минКАХЛлл,ЕдКАХЛлнЕдNO3/NO2,мкМ/лПримечание:* - p <0,05 по сравнению с контролемПри анализе данных таблицы 5.1 статистически значимых закономерностейвыявлено не было.58Таблица 5.2 - Средняя функциональная активность нейтрофилов и возрастбольных СКВ, Me (Q25–Q75)IIСредняя ФАПоказательКонтроль104, имп/минсХЛлн,104, имп/миниХЛлн,104, имп/минКАХЛлл,ЕдКАХЛлнЕдNO3/NO2,мкМ/лнейтрофиловАВАВМолодойЗрелыйМолодойЗрелый(n=15)(n=12)1,11,01,0(0,2-3,0)(1,0-3,2)(1,0-3,2)0,150,620,551,50,9(0,2-1,1)(0,75-2,0)(0,8-2,0)0,690,260,31,01,0(0,1-0,9)(0,2-1,0)(1,0-1,0)0,330,811,691,00,98(0,9-3,3)(0,5-1,2)(0,6-1,0)0,710,160,750,50,6(0,3-1,5)(0,41-0,8)(0,5-1,11)0,250,213,61,661,4(3,3-4,1)(0,9-2,3)(0,9-2,5)0,540,13(n=25)иХЛлл,pПримечание:* - p <0,05 по сравнению с контролемКак видно из представленных в таблице 5.2 данных статистическизначимых закономерностей не выявлено.59Таблица 5.3 - Высокая функциональная активность нейтрофилов и возрастбольных СКВ, Me (Q25–Q75)IIIВысокая ФАПоказательКонтроль104, имп/минсХЛлн,104, имп/миниХЛлн,104, имп/минКАХЛлл,ЕдКАХЛлнЕдNO3/NO2,мкМ/лнейтрофиловАВАВМолодойЗрелыйМолодойЗрелый(n=11)(n=2)1,112,50,10,290,44(0,2-3,0)(1,1-39,0)(0,1-0,1)0,551,61,550,680,18(0,2-1,1)(1,2-2,7)(1,4-1,7)0,31,00,10,610,91(0,1-0,9)(0,9-1,2)(0,1-0,1)1,691,440,0090,320,54(0,9-3,3)(0,06-2,9)(0,009-0,01)0,750,710,150,840,47(0,3-1,5)(0,3-0,75)(0,06-0,3)3,61,41,550,270,35(3,3-4,1)(0,6-1,9)(0,4-2,7)(n=25)иХЛлл,pПримечание:* - p <0,05 по сравнению с контролемТаким образом, при анализе данных таблиц 5.1 – 5.3 статистическизначимых закономерностей выявлено не было.