Методы разделения и очистки белков, страница 10

Для изократическойэлюции (раствором постоянного состава) отнош ение диаметраколонки к ее длине не должно превыш ать 1:20, а при ступенчатой50или непрерывной градиентной элюции - 1:5. Объем колонкизависитотемкостисорбентаиколичествананосимойфракционируемой смеси (вернее, количества веществ, сорбируемыхна носителе). Оптимальная скорость элюции обычно подбираетсяэмпирически и определяется процессами установления равновесиямежду подвижной и неподвижной фазами. Для больших молекулбиополимеров из-за их медленной диффузии такое равновесиеустанавливается дольш е, следовательно, скорость элюции должнабыть, соответственно, меньше.

На обычных колонках низкогодавления скорость элюции варьирует в ш ироких пределах от 50-100мл/см2-ч для низкомолекулярных соединений до 2-5 мл/см2-ч длякрупных белков.Регенерация ионообменника. Полную очистку носителя отостатков сорбированных на нем веществ осущ ествляют егопромыванием 1-2 М раствором N aCl или КС1, после чего отмываютводой и уравновеш иваю т буфером. Из-за существенного сжатиянекоторых сорбентов (волокнистая целлюлоза, ионообменныесефадексы и др.) в таких солевых растворах регенерацию носителялучше производить, перенося сорбент из колонки в химическийстакан с большим объемом солевого раствора.Ионообменная хроматография широко применяется не толькодля ф ракционирования веществ, но и для их концентрирования (см.выше).

При этом из больш ого объема разбавленного растворавещество сорбируется на носителе, а затем элюируется небольшимобъемом раствора с высокой концентрацией соли или за счетизменения pH.9.7. Вы сокоэффективная жидкостнаяхроматография(ВЭЖ Х) или жидкостная хроматография высокого давления(Ж ХВД) (H PLC - High Perform ance Liquid Chromatography).Для того чтобы обеспечить быстрое протекание элюента черезколонки с гранулами мелкого диаметра (<10 мкм), требуется создатьперепад давления в 200-300 атмосфер.

Это стало возможным послесоздания особых колонок (из легированной стали) (рис. 17),специальной аппаратуры, а главное, особо жестких носителей наоснове силикагеля (окиси кремния), способных выдерживать такоевысокое давление. Основныепринципыразличныхвидовхроматографии при этом не изменились.51Н № >- тж +ш ш - - .................... ......................•оянии-« н аРис.

17. Колонки для жидкостнойдавления [http://im ages.google.ru].хроматографиивысокогоНаверное, единственным недостатком Ж ХВД являетсядовольно высокая стоимость оборудования и колонок. Поэтому всередине80-хгодовфирма«Pharmacia»предложила«промежуточный»вариантхроматографическихколонокиоборудования - FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography).

Диаметргранул сорбента для колонок FPLC составляет 10+0,1 мкм ихарактеризуется высокой однородностью (разброс диаметра гранулвсего 1%), что позволяет, несмотря на малый размер гранул,ограничить давление до 30-50 атмосфер (хроматография среднегодавления). При этом разделение белков (как и в случае HPLC)занимает несколько минут или десятков минут.В настоящее время для фракционирования белков широкоиспользуются все виды хроматографии низкого, среднего ивысокого давления в зависимости от целей эксперимента иоснащенности лаборатории.

Но, поскольку в рамках практикумастуденты используют лишь хроматографию низкого давления, мыпосчитали целесообразным в данном методическом пособииподробнее обсудить именно этот способ разделения белков.10. Кристаллизация белков.Очистку белков часто заканчивают их кристаллизацией. Онаиспользуется для различных целей: 1) как метод очистки белка; 2)как способ стабилизации белков (особенно ферментов) прихранении; 3) для определения структуры белков методомрентгеноструктурного анализа и т.п.52«Правильные» кристаллы формируются в перенасыщенныхбелковых растворах за счет упорядоченной упаковки молекул белка(в результате беспорядочной агрегации образуются аморфныеосадки).

Создать условия, в которых белковый раствор становитсяперенасыщенным, можно с помощью лю бого осадителя (см. выше).Чаще всего для этой цели используют сульфат аммония, однакоэффективнымтакжебываетприменениеорганическихрастворителей, например, полиэтиленгликоля. На кристаллизациювлияют многие факторы, такие как температура, pH, ионная сила исостав раствора, в котором находится белок. Для каждого белка этиусловия подбираются экспериментально.Кристаллы белков формируются довольно медленно, преждевсего из-за медленной диффузии довольно крупных белковыхмолекул. Кроме того, далеко не все столкновения молекул белка (атолько столкновенияправильноориентированныхмолекул)приводят к упорядоченной агрегации и образованию «правильного»кристалла.

Поэтому кристаллизация белков может заниматьдовольно длительное время (дни, недели и даже месяцы). Быстрееобразуются микрокристаллы, как правило, имеющ ие удлиненную,иглоподобную форму.Приформированиикристалловдлядальнейшегорентгеноструктурного анализа должны соблюдаться довольножесткие требования к условиям их выращивания. Для других целей,когда быстрота роста кристалла важнее их размеров, процедуравыращивания кристалла не сопровождается никакими сложностями.Часто она является конечным этапом очистки белков, так какпозволяет при правильно подобранных условиях получить осадоквыделяемого белка, тогда как примесные белки остаются всупернатанте.

Таким образом, быстрая кристаллизация, а принеобходимостипоследующаяперекристаллизация(повторнаякристаллизация), оказываются в ряде случаев эффективнымиспособами фракционирования и очистки. Стационарное состояние,достигнутое в результате последовательных перекристаллизаций,при котором удельная активность фермента не возрастает, являетсяодним из критериев гомогенности данного препарата фермента.Другимважнымдостоинствомкристаллизации,определяющ им ее широкое применение, является то, что онаспособствует сохранению очищ енных белков в течение длительноговремени. М ногие фирмы выпускают препараты ферментов в видесуспензии кристаллов, так как это один из самых надежныхспособов их хранения.

Стабильность закристаллизованных белков(ферментов)определяетсярядомпричин.Так,высокие53концентрации соли (как правило, сульфата аммония) в суспензиикристаллов предотвращ ают бактериальное загрязнение препарата.Кроме того, хотя протеиназы теоретически могут адсорбироватьсяна поверхности кристаллов очищ енного белка (фермента),вероятность их кристаллизации вместе с очищенным белком(ферментом)достаточномала,поэтомувероятностьпротеолитического расщ епления белков в суспензии кристаллов невысока.Таким образом, кристаллизация (и перекристаллизация) полезный и продуктивный способ фракционирования, очистки истабилизации белков.11.Критерии чистоты белкового препарата иидентификация.Получивврезультатедлительногомногостадийноговыделения препарат белка, бывает необходимо оценить его чистоту.Единоготеста,доказываю щ егогомогенностьполученногопрепарата, не существует.

На основании одного какого-либо тестаможно судить о чистоте препарата лишь с некоторой долейвероятности. Если же белок оказывается гомогенным порезультатам нескольких различных тестов, эта вероятностьзначительно увеличивается, и белок может быть признангомогенным.Большинство тестов на гомогенность основаны на различиях вфизико-химических свойствах белков. К их числу относятсяульт рацент риф угирование и гель-хромат ограф ия, позволяющиеоценить молекулярную массу белка. Однако в обоих случаяхнеобходимо учитывать возможность совпадения соответственноконстант седиментации и молекулярных масс различных белков, атакже влияние формы молекулы на конечные результаты.Симметричный белковый пик, полученный не только врезультате гель-хроматографии, но и при других видах колоночнойхроматографии, также свидетельствует о гомогенности белка.Очень весомым доказательством чистоты белка служит однаокрашенная узкая белковая зона, полученная при электрофорезе какв нативных, так и в денатурирующ их условиях (в присутствииДСН).

О днако если белок состоит из нескольких различающихся помолекулярноймассесубъединиц,послеэлектрофорезавденатурирующ их условиях будет выявлено несколько окрашенныхзон.Одним из наиболее сильныхдоказательств гомогенностибелков, безусловно, являются единственные N - и/или С-концевые54егоаминокислотные остатки, выявленные в препарате исследуемогобелка.Благодаря тому, что изоэлектрофокусирование позволяетразличать даже белки, изоэлектрические точки которых отличаютсявсего на 0,01 единицу pH, результаты, полученные этим методом,также являются очень важным аргументом в пользу гомогенностибелка.Хорошим доказательством чистоты полученного препаратабелка могут также стать результаты двумерного электрофореза.Двумерный электрофорез проводят в две последовательные стадии.На первой стадии белок наносят на узкую полоску геля сградиентом pH.

Под действием электрического тока в зависимостиот величины изоэлектрической точки и pH среды заряженный белокдвижется к катоду или аноду до тех пор, пока не попадает в зонугеля, где его суммарный заряд становится нулевым (рН=р1). Белокостанавливается и «фокусируется». Затем полоску геля сразделенными на первой стадии белками заполимеризовываю т вдругуюпластинуПААГи проводят электрофоретическоеразделение в присутствии ДСН в направлении, перпендикулярномисходному.

Таким образом, белки делят сначала по заряду, а затемпо молекулярной массе. О дна окраш енная белковая зона с оченьвысокойстепеньювероятностидоказываетгомогенностьполученного белкового препарата. Однако наличие несколькихбелковых зон не всегда свидетельствует об обратном, например,если белок подвергается посттрансляционным модификациям, то врезультате двумерного электрофореза может быть выявленонесколько пятен.Д оказать наличие в полученном препарате определенногобелка и оценить его чистоту можно методом иммуноблоттинга(вестерн-блоттинга) (от англ. Western blotting).