Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки, страница 9

Однакопозднее RheothRx был снят с третьей фазы клинических испытаний в связи с его токсичностьюдля почек [172].Сильный токсический эффект in vivo был обнаружен у гидрофобного плюроника L101,который при попытках использовать его в качестве иммуноадъюванта, т.е. усилителяиммунного ответа, вызывал ярко выраженную воспалительную реакцию [173]. Причинатоксичности плюроников для организма не выяснена.Связьмеждуструктуройплюроникаиеготоксичностьюбылавпервыепродемонстрирована на животных.

Количественная оценка токсичности плюроников35основывалась на определении уровня креатинфосфокиназы в крови после инъекциисополимера. Увеличение концентрации данного фермента в крови пропорционально степениповреждения мышечных тканей. Тестирование ряда плюроников (F88, F127, P105 и P123)показало, что, чем гидрофобнее плюроник, тем сильнее было повреждение мышц и тем вышебыл уровень креатинфосфокиназы в крови. Так, плюроники Р105 и Р123, обладающиесредними значениями ГЛБ, были признаны токсичными, тогда как гидрофильные плюроники(F127 и F88) по своей токсичности были сопоставимы с изотоническим раствором,Кремафором EL и арахисовым маслом.

Изучение этого вопроса привело исследователей кважному выводу: чем гидрофильнее сополимер, тем ниже его токсичность [174].Этот вывод подтвердился в трех работах при анализе токсичности плюроников дляклеток в культуре (цитотоксичность), где на одних и тех же клеточных линиях в одинаковыхусловиях тестировали разные полимеры. Так, в работе [167] на трех линиях клеток былаисследована цитотоксичность трех плюроников, различающихся по гидрофобности – F127(ГЛБ=25), P85 (ГЛБ=16) и L61 (ГЛБ=2-3). Показано, что наиболее гидрофильный плюроникF127 не был токсичен ни для одной из клеточных линий вплоть до концентрации 1%.Цитотоксичность плюроника Р85 была обнаружена при концентрации ≥ 0,05%, а гидрофобныйL61 оказался наиболее токсичным из трех полимеров и уже при концентрации 0,005%приводил к снижению количества клеток. Таким образом, чем гидрофобнее полимер, тем онтоксичнее, и тем меньше его концентрация, при которой становится заметной гибель клеток(наибольшая нетоксичная концентрация, ННК).

Тенденция снижения ННК по мереуменьшения гидрофильности полимера была также показана при сравнительном исследованиивлияния плюроников F127, L64 и L61 на выживаемость клеток линии Сасо-2. Плюроник F127не вызывал гибели клеток во всем диапазоне концентраций от 0,0005% до 1%, плюроник L64оказался нетоксичным вплоть до 0,05 – 0,1%, а плюроник L61 - до 0,01 – 0,05% [139].Такое же закономерное изменение свойств характерно и для блок-сополимеров,содержащих в качестве гидрофобного блока не ППО, а полидиметилсилоксан [175].

Авторысинтезировали трехблочные сополимеры структуры ПЭО-ПДМС-ПЭО, содержавшие от 10 до16 звеньев диметилсилоксана в гидрофобном блоке и от 4 до 44 звеньев этиленоксида вкаждом гидрофильном блоке. Токсичность этих блок-сополимеров тестировали на первичнойкультуре фибробластов человеческой кожи. Наиболее токсичными оказались полимеры скороткими ПЭО блоками. Сополимеры на основе полидиметилсилоксана, содержавшие только4 - 8 звеньев этиленоксида, в концентрации 0,1-1% подавляли рост клеток на 50-80%. В то жевремя гидрофильные блок-сополимеры с 44 звеньями ЭО были не токсичны во всем диапазонетестированных концентраций от 0,001% до 1%.36Следует отметить, что сведения о цитотоксичности плюроников носят фрагментарныйхарактер.

В одной работе была определена наибольшая нетоксичная концентрация плюроникаР123, которая составила 0,6%, на двух линиях раковых клеток (инкубация 1 ч) [176]. Анализцитотоксичности еще четырех плюроников проводился в нескольких лабораториях. При этомобращает на себя внимание существенный разброс результатов этого анализа для одного итого же плюроника.Так, плюроник F127 нетоксичен для клеток аденокарциномы толстой кишки человекалинии Сасо-2 вплоть до концентрации 5% [165]. Однако для клеток линии 3T3 EWS-FLI1 оноказался токсичным при концентрации выше 0,05% [177].По данным разных авторов плюроник Р85 не токсичен для клеток различных линийвплоть до концентрации 0,001% [119], 0,05% [167], 0,1% [168], 0,5% [176] или 5% [101].Аналогичная ситуация наблюдается и для плюроника L61. В одной работе он проявлялцитотоксичность при концентрациях выше 0,005% [167], в другой - при 0,01% [139], а втретьей - при 0,03% [168].Как видно из приведенных примеров, максимальная нетоксичная концентрация одногои того же плюроника, определенная в разных работах, может варьировать в пределахнескольких порядков.

Это обусловлено разными условиями постановки экспериментов поопределению цитотоксичности полимеров. Значение имеет длительность инкубации клеток сполимером [121, 178]. Так, минимальная токсичная концентрация плюроника Р85 равная0,001% была определена при инкубации чувствительных и устойчивых клеток рака молочнойжелезы человека линий MCF7 и MCF7/R в присутствии полимера в течение 72 ч [119]. Нарезультат также может влиять наличие сыворотки в среде культивирования, если дляпроведения опыта полимеры растворяли в полной культуральной среде [176]. Высказанопредположение, что белки сыворотки могут включаться в мицеллы плюроников и влиять напроцесс мицеллообразования путем гидрофобных взаимодействий с ППО-блоком [179, 180].Возможно эти факторы влияют на биологические эффекты сополимеров.Механизм токсического эффекта плюрониковРанее в литературе был предложен трехступенчатый механизм взаимодействиянеионогенного ПАВ с клеточной мембраной [181].

В зависимости от сродства ПАВ кмембране процесс ее растворения может происходить в разной степени. На первом этапе, прималой концентрации ПАВ, его молекулы внедряются в мембрану, не разрушая ее. На второмэтапе в мембране присутствуют смешанные мицеллы, состоящие из молекул белков, липидови ПАВ, которые находятся в равновесии с мицеллами самого ПАВ и его неассоциированнымимолекулами. И, наконец, на третьем этапе, при добавлении достаточного количества ПАВ,возможно образование мицелл, состоящих из белка и ПАВ, находящихся в равновесии со37смешанными мицеллами из ПАВ и липида и, собственно, с мицеллами самого ПАВ.Предполагается, что формирование таких смешанных мицелл в клеточной мембране можетприводить к ее деструкции.В работе по исследованию токсичности плюроников было высказано предположение,что амфифильные неионогенные плюроники так же действуют на клеточную мембрану, какПАВ, и именно нарушение целостности плазматической мембраны является причиной ихтоксического действия на клетки [174].Это предположение нашло экспериментальное подтверждение в работе M.

Redhead ссоавт., которые исследовали взаимодействие плюроников различного состава с человеческимиклетками карциномы кишечника линии Caco-2, эпителиальными клетками линии HMEC-1 инормальными эритроцитами человека. Клетки инкубировали с полимерами, добавленными вразличной концентрации, в течение 5 ч и затем определяли количество клеток, оставшихсяживыми, а также регистрировали появление внутриклеточных белков в среде инкубации [139].При исследовании скорости гемолиза эритроцитов человека под действием плюроника L61,обнаружено, что этот процесс развивается во времени и достигает 100% спустя 1 ч инкубациис полимером [178]. Следовательно, токсичность развивается быстро. Этот результатысвидетельствуютпротивтриггерногомеханизма цитотоксичности,когдаплюроникивыступают в роли индукторов изменений внутриклеточного метаболизма, постепенноеразвитие которых приводит к гибели клетки.

Примером таких изменений метаболизма можетслужить апоптоз, который развивается на протяжении приблизительно трех суток.Приведенные результаты скорее указывают на то, что цитотоксичность обусловленанепосредственным воздействием плюроников на наружную клеточную мембрану.

Авторыинтерпретируют появление внутриклеточных белков в среде инкубации как увеличениепроницаемости наружной клеточной мембраны под действием плюроника.Таким образом, все рассмотренные полимеры в той или иной степени проявляюттоксичность, что продемонстрировано в экспериментах как in vitro, так и in vivо. Неопределена цитотоксичность плюроника F68. Он не токсичен для клеток в культуре вплоть до1%. Сопоставление наибольших нетоксичных концентраций плюроников F127, Р85, Р123, L64и L61 свидетельствует о связи между структурой полимера и его токсичностью: чемгидрофобнее полимер, тем он токсичнее для клеток и тем меньше его концентрация, к которойклетки толерантны. Эта закономерность проявляется независимо от типа исследованныхполимеров (плюроники или сополимеры на основе полидиметилсилоксана) и методов анализаих токсичности.

В случае плюроников наиболее токсичны гидрофобные полимеры с блокомППО средней степени полимеризации (30 - 60 звеньев) и малой длиной блока ПЭО (10 - 50%массы всей молекулы). Такая длина гидрофобного ППО-блока сопоставима с толщиной38плазматической мембраны, что может способствовать встраиванию полимера в липидныйбислой [182]. В то же время малая длина гидрофильного блока не препятствуетвзаимодействию плюроника с мембраной. Можно предположить, что эти особенностиструктуры и строения и обусловливают высокую цитотоксичность таких полимеров.Количественная корреляция между соотношением гидрофобного и гидрофильныхблоков полимера и его цитотоксичностью пока не описана. Систематическому изучениютоксического действия плюроников на клетки в культуре уделено немного внимания влитературе.

Нам удалось найти такого рода сведения только для шести плюроников. Вподавляющем большинстве работ цитотоксичные концентрации этих полимеров былиустановлены путем последовательного разведения тестируемого раствора полимера в 10 раз,что не позволяло получить достаточные точные значения ННК.

Влияние мицеллообразованияна цитотоксичность плюроников не исследовалось.1.4. Защитная роль плюрониковНекоторые гидрофильные плюроники способны оказывать на клетки действие прямопротивоположное токсичности, а именно, защищать их от различного рода повреждений испособствовать восстановлению целостности клеток.Наиболее широкое применение в этой сфере нашел плюроник F68 (полоксамер-188).