Световодные системы для нейрофотоники, страница 5

10. (а) Изображение антирезонансного волокна с полой сердцевиной и спектр пропускания данного волокна. Длина волны лазера накачки показана штриховой линией. (б-в) Спектрально разрешенные сигналы,собранные с помощью (б) полого антирезонансного и (в) стандартного волокон: исходный спектр 20 мМ водного раствора EdU (красная кривая), фон вследствие комбинационного рассеяния волокна (зеленая кривая)и спектры после процедуры вычитания фона (синяя кривая).Нелинейная оптика открывает уникальные возможности для биовизуализации. Двухфотоннаямикроскопия позволяет регистрировать функциональные изменения в клетках живой ткани благодаря специальным маркерам, в то же время микроскопия, основанная на генерации третьей гармоники (ГТГ), является многообещающим методом для изучения структурных изменений.

Исследование мозга как сложного физического объекта требует одновременной визуализации структурныхи функциональных особенностей, и каждая из описанных методик микроскопии при правильномкомбинировании может привнести уникальную часть информации. В разделе 4.4 была реализованаэкспериментальная схема для исследования влияния свойств различных структур мозга и биомаркеров на эффективность генерации третьей оптической гармоники. Для ГТГ требуется бо́льшаядлина волны излучения накачки, чем обычно используется в микроскопии двухфотонного поглощения.

Оптимальный контраст в микроскопии ГТГ достигается в диапазоне от 1200 до 1300 нм, таккак, бо́льшие длины волн эффективно поглощаются молекулами воды, а в случае более коротковолновой накачки сигнал третьей гармоники лежит в ультрафиолетовой области, что приводит к егосильному поглощению в биотканях. Поэтому в экспериментах использовалось излучение фемтосекундного лазера на кристалле Cr:F с центральной длиной волны 1260 нм.

Энергия была сниженадо 1 нДж, для избежания фотоповреждений. Сигнал на частоте третьей гармоники фильтровалсяот основного излучения с помощью оптических фильтров и дихроичных зеркал и детектировался15с помощью ФЭУ и синхронного усилителя.Известно, что условия фазового согласования для ГТГ управляются составом и структуройматериала в фокусе.

Ткани мозга состоят из большого числа аксонов и дендритов с характерными диаметрами в диапазоне 0.3-2 мкм, миелиновая оболочка которых по сути состоит из липидовимеющих большое значение нелинейной восприимчивости третьего порядка χ(3) . Подбирая размерконфокального параметра сравнимым по размеру со средним аксоном, мы получаем геометрию, вкоторой условия фазового согласования обеспечивают эффективную ГТГ от отростков. В этом случае нейроны, состоящие из органелл, размеры которых много меньше конфокального параметра, небудут генерировать сигнал третьей гармоники. На Рис. 11(а) представлены результаты измеренийобласти в соматосенсорной коры среза мозга мыши линии C57Bl/6.

Клетки на данной карте проявляются как области с отсутствием сигнала (На Рис. 11(а) хорошо различимы 4 клетки). Полученныеизображения демонстрируют высокий контраст, возможность разрешения морфологических деталей и субклеточное разрешение.Рис. 11.

(а) Карта сигнала третьей гармоники от среза мозга мыши. Клетки проявляются как темные области. (б) Спектры поглощения красителей EGFP (синий цвет) и Cresyl Violet (красный цвет). (в) Карта сигнала третьей гармоники от среза мозга стандартной C57Bl/6 мыши, дополнительно окрашенного красителемCresyl Violet. Данный краситель инвертирует ГТГ и клетки проявляются как яркие области. (г-д) Комплексная микроскопия срезов мозга: (г) неинвертированный сигнал третьей гармоники. (д) сигнал однофотоннойфлуоресценции от одной и той же области соматосенсорной коры на срезе мозга Zif-EGFP мыши.Таким образом, микроскопия ГТГ позволяет безмаркерно визуализировать морфологию тканей мозга, что могло бы быть полезно в ряде исследований особенно при сочетании ее с картамифункциональных изменений, визуализируемых по флуоресценции дополнительных красителей.

Однако известно, что любой резонанс увеличивает значение χ(3) , тем самым радикально изменяя картуГТГ, а используемым флуоресцентным маркерам присущи широкие полосы поглощения и, следова16тельно, резонансы. Например, в работе было экспериментально показано, что маркер Cresyl Violetполностью инвертирует карты распределения сигнала третьей гармоники из-за наличия двухфотонного резонанса. На Рис. 11(б) красной линией представлен спектр поглощения маркера CresylViolet. Теперь именно прокрашенные клетки эффективно генерируют сигнал третьей гармоники,не позволяя тем самым визуализировать морфологию независимо от дополнительного красителя(Рис.

11(в)).Было экспериментально показано, что существуют условия, в которых возможно использование широко распространенного маркера EGFP совместно с микроскопией ГТГ без измененияконтрастности сигнала третьей гармоники. На Рис. 11 представлены экспериментальные результаты: (г) - карта третьей гармоники, (д) - соответствующая ей карта сигнала флуоресценции EGFP.Видно, что в случае накачки на длине волны 1260 нм, флуоресцентный белок EGFP не обладаетрезонансами (синяя линия на Рис. 11(б) и, таким образом, не влияет на генерацию сигнала третьейгармоники (Рис.

11(г)).В Заключении сформулированы основные результаты и выводы диссертационной работы,которые перечислены ниже:I. Показано, что микроструктурированные волокна с малым размером сердцевины увеличивают локальность оптического зондирования в волоконно-оптических форматах визуализации.Экспериментально показано, что МС волокно с радиусом сердцевины ≈ 1 мкм и числовойапертурой 0.38 может ограничивать оптическое зондирование в области объемом меньше чем50 мкм3 , позволяя оптический опрос отдельных нейронов в рамках типичного экспериментапо визуализации мозга.II.

Экспериментально показано, что оптоволоконный микрозонд, состоящий из ≈ 6000 волоконс диаметром сердцевины каждого отдельного волокна 2.4 мкм, соединенный с конфокальнымоптическим микроскопом позволяет in vivo визуализировать пространственное распределениеодновременно нескольких флуоресцентных маркеров в мозге живого свободноподвижногоживотного с субклеточным разрешением равным 3 мкм.III.

Экспериментально показано, что МС волокна, в которых генерируется широкополосное излучение суперконтинуум с широким спектром от 420 до 1000 нм, могут быть интегрированы с волоконными спектральными фильтрами на основе полых антирезонансных световодовдля реализации одновременной многоцветной регистрации флуорофорных маркеров в мозгетрансгенных животных, что обеспечивает путь к полностью волоконному формату мультиплексного зондирования.IV. Экспериментально продемонстрировано, что МС волокно со сконструированным должнымобразом профилем дисперсии обеспечивает плавную перестройку излучения от 800 до 140017нм и позволяет точно подобрать длину волны солитона на выходе волокна к спектру двухфотонного поглощения любого флуоресцентного биомаркера, усиливая таким образом откликдвухфотонной флуоресценции, что может быть использовано для нелинейно-оптического зондирования в волоконном формате.V.

Разработан волоконно-оптический нейроинтерфейс, который, как было экспериментально показано, позволяет минимально инвазивно проводить измерения уровня экспрессии флуоресцентных маркерных белков в глубоких слоях мозга живых животных в течение длительноговремени (до одного месяца) при их свободном поведении во время и после разнообразныхфизиологических и фармакологических воздействий, а также позволяет проводить измеренияуровня флуоресценции одновременно из нескольких пространственно разнесенных структурмозга живого животного.VI. Экспериментально продемонстрировано, что пространственное распределение веществ с комбинационно активными линиями может быть визуализировано в волоконном формате в режиме эндоскопии с разрешением 3 мкм методом регистрации спонтанного комбинационногорассеяния света.VII.

Экспериментально показано, что антирезонансные волокна с полой сердцевиной позволяютувеличить до 17 раз чувствительность волоконно оптической регистрации маркеров пролиферации клеток с помощью спонтанного комбинационного рассеяния по сравнению со стандартными световодами, таким образом, значительно улучшая чувствительность химическиселективного зондирования синтеза ДНК в клетках и предлагая мощный инструмент для волоконно-оптической визуализации живых клеток.VIII. Показано, что когерентное подавление генерации третьей гармоники в жестко сфокусированных лазерных пучках позволяет осуществлять высокоточную безмаркерную визуализациюотдельных нейронов в тканях мозга; и экспериментально показана возможность комбинацииметода микроскопии генерации третьей гармоники с флуоресцентными методами микроскопии без изменения контрастности сигнала третьей гармоники.18Список публикаций автора по теме работы1.

L. V. Doronina, I. V. Fedotov, A. A. Voronin, O. I. Ivashkina, M. A. Zots, K. V. Anokhin, E. V.Rostova, A. B. Fedotov, and A. M. Zheltikov Tailoring the soliton output of a photonic crystal fiberfor enhanced two-photon excited luminescence response from fluorescent protein biomarkers andneuron activity reporters // Optics Letters.

2009. Vol. 34(21), P. 3373-3375.2. I. V. Fedotov, A. B. Fedotov, L. V. Doronina, and A. M. Zheltikov Enhancement of guided-wavetwo-photon-excited luminescence response with a photonic-crystal fiber // Applied Optics. 2009.Vol. 48, no. 28, P. 5274–5279.3. L. V. Doronina-Amitonova, I. V. Fedotov, O. I. Ivashkina, M. A. Zots, A. B.

Fedotov, K. V. Anokhin,and A. M. Zheltikov Fiber-optic probes for in vivo depth-resolved neuron-activity mapping //Journal of Biophotonics. 2010. Vol. 3, no. 10–11, P. 660–669.4. L. V. Doronina-Amitonova, I. V. Fedotov, O. I. Ivashkina, M. A. Zots, A. B. Fedotov, K. V. Anokhin,and A. M. Zheltikov Photonic-crystal-fiber platform for multicolor multilabel neurophotonic studies// Applied Physics Letters.

2011. Vol.98, P. 253706.5. L. V. Doronina-Amitonova, A. A. Lanin, O. I. Ivashkina, M. A. Zots, A. B. Fedotov, K. V. Anokhin,A. M. Zheltikov Nonlinear-optical brain anatomy by harmonic-generation and coherent Ramanmicroscopy on a compact femtosecond laser platform // Applied Physics Letters. 2011. Vol. 99, P.231109.6. A. A. Voronin, I. V. Fedotov, L. V. Doronina-Amitonova, O. I. Ivashkina, M.

A. Zots, A. B. Fedotov,K. V. Anokhin, and A. M. Zheltikov Ionization penalty in nonlinear Raman neuroimaging // OpticsLetters. 2011. Vol. 36, no. 4, P. 508–510.7. L. V. Doronina-Amitonova, I. V. Fedotov, O. I. Ivashkina, M. A. Zots, A. B. Fedotov, K. V. Anokhin,and A. M. Zheltikov Enhancing the locality of optical interrogation with photonic-crystal fibers //Applied Physics Letters.