Световодные системы для нейрофотоники, страница 3

2(г) представлена рассчитанная мощность флуоресцентного сигнала, собранного волоконным зондом, как функция эффективного радиуса моды am и числовой апертуры NA, для постоянной интенсивности излучения накачки. Сплошные линии показывают изолинии постоянного объема оптического зондирования. Видно, что существует компромисс между чувствительностью (уровнем зарегистрированного отклика) и локальностью, который достигается путем правильного подбора параметров волокна: увеличение радиуса сердцевины до приемлемого разрешения с одновременным увеличением NA (для постоянноймощности накачки Рис.

2(г)). Исходя из этого было теоретически предсказано, что использованиеволокна с радиусом 2.5 мкм и NA = 0.7 для зондирования нейронов с типичным объемом в 200мкм3 позволит больше чем на порядок увеличить уровень сбора некогерентного отклика.Было теоретически показано, что диаметр сердцевины около 2-2.5 мкм позволяет различатьотдельные клетки мозга с максимальной чувствительностью. В разделе 3.2 было экспериментально7продемонстрировано, что подобранный волоконный зонд, состоящий из 6000 волокон, с диаметромсердцевины отдельного волокна в 2.4 мкм в комплексе с конфокальным микроскопом обеспечиваетin vivo визуализацию нейронов в мозге живых животных с высоким пространственным и временным разрешением.Многокомпонентная визуализация является ключевым инструментом в биологии, так как вогромном классе задач просто необходимо одновременно регистрировать сразу несколько параметров исследуемой живой системы. В разделе 3.2 была показана возможность волоконно-оптической in vivo визуализации с высоким пространственным и временным разрешением одновременнонескольких биомаркеров на примере визуализации маркеров EGFP, DAPI dilactate и Neurotrace Nissl640/660 в мозге живой мыши.

Для этого излучение трех диодных лазерных источников на длинахволн 405, 473 и 559 нм, последовательно заводилось в отдельные волокна в пучке с помощью объектива (20x, NA = 0.5) и двух гальванометрических зеркал, ортогонально сканирующих лазернымлучом входной торец пучка. Построение изображения осуществлялось путем последовательногосчитывания с помощью ФЭУ сигнала из отдельных точек (пикселей) картины (Рис. 3(а)). Это позволяло максимально эффективно заводить излучение разных длин волн в волокна с небольшимразмером сердцевины в автоматическом режиме.(а)(б)(в)Рис. 3.

(а) Схема многоцветной визуализации мозга с помощью микрозонда из пучка волокон, соединённого с микроскопом: GM, гальванометрические сканирующие зеркала; Obj, объектив; L1, L2, линзы;F1, F2, F3, фильтры; PMT, фотоумножители. (б-в) Распределение двух маркерных красителей в нейронахзубчатой фасции гиппокампа трансгенных мышей линии Thy1-EGFP, дополнительно прокрашенных DAPIdilactate, зарегистрированное in vivo с помощью многосердцевинного оптоволокна (б) и in vitro на конфокальном микроскопе (в). Синим цветом визуализированы ядра клеток (краситель DAPI dilactate), зелёнымThy1-EGFP-позитивные клетки.На Рис. 3(б) представлены результаты эксперимента по in vivo получению изображения вформате эндоскопии и их сравнение со стандартным in vitro методом конфокальной микроскопии(Рис.

3(в)). Видно, что уровень пространственного разрешения, достигнутый с помощью волоконно-оптического метода визуализации, является достаточным для зондирования отдельных нейронов вместе с самыми крупными отростками, как было рассчитано в проведенном теоретическоммоделировании. Данное разрешение не подходит для визуализации более мелких деталей пространственной структуры клеток, таких как дендриты, которые видны на изображениях полученных наконфокальном микроскопе.

При необходимости, как было показано выше, эта проблема может бытьрешена с использованием МС волокон с субмикронным диаметром сердцевины.8Остается еще одна проблема, заключающаяся в необходимости использовать одновременнонесколько лазеров накачки. В настоящее время задачи многокомпонентного зондирования требуютодновременного использования нескольких лазерных систем накачки: для линейной флуоресцентной микроскопии это набор лазеров в видимом диапазоне; для двухфотонной микроскопии этофемтосекундные лазеры на кристаллах Ti:S и Cr:F. В разделах 3.3 и 3.4 было предложено использование только одного лазера накачки в комбинации с МС волокном для задач одновременногомногокопонентного зондирования как в линейном, так и в нелинейном режимах, совмещающее всебе возможность компактной полностью волоконной реализации.Для демонстрации мультиплексного возбуждения и регистрации в случае однофотонного возбуждения использовалось совмещение уникальных свойства высоконелинейных МС волокон ствердотельной сердцевиной как источников широкополосного излучения суперконтинуум со свойствами полых фотонно-кристаллических (ПФК) волокон для реализации функции спектральногофильтра (Рис.

4(а)). Для получения излучения суперконтинуум использовалось волокно, структуракоторого показана на вставке к Рис. 4(б), с диаметром сердцевины 2 мкм и нулевой дисперсиейгрупповых скоростей в районе 770 нм. Источник оптической накачки (фемтосекундный Ti:Sapphireлазер) генерировал импульсы длительностью 50 фс, на центральной длине волны 810 нм (спектрпоказан пунктиром на Рис. 4(б)), частотой повторения 90 МГц и энергией 6 нДж, которые заводились в МС волокно. Внутри волокна лазерные импульсы накачки испытывают влияние целого ряданелинейно-оптических процессов, таких как фазовая самомодуляция, генерация множественныхсолитонов, комбинационное рассеяния и солитонный самосдвиг частоты (СССЧ). Как результат,МС волокно преобразовывает спектр импульсов накачки в излучение суперконтинуум со спектром, простирающимся более чем на одну октаву от 430 до 970 нм (синяя линия Рис.

4(б)), которыйможет использоваться для возбуждения практически любого красителя. Структура ПФК волокнареализована так (вставка к Рис. 4(в)), чтобы поддержать распространение только той части суперконтинуума, которая может эффективно возбуждать флуоресценцию биомаркеров (Рис. 4(в)). Вспектральной полосе, где биомаркеры излучают флуоресценцию, ПФК не пропускает излучение накачки, таким образом эффективно уменьшает зашумляющее влияние рассеянного от исследуемыхтканей излучения суперконтинуум, что, в свою очередь, повышает чувствительность регистрации.Одновременно измеренные с помощью описанной системы однофотонные спектры люминесценции красителей EGFP и Alexa Fluor 594 в мозге мыши представлены на Рис 5(а).Универсальный источник для возбуждения нескольких красителей в двухфотонном режиметакже может быть основан на фемтосекундном Ti:S осцилляторе и МС волокне, как описано в разделе 3.4.

Конструкция сердцевины и внутренней части оболочки МС волокна нацелена на достижение высокой нелинейности и дисперсионного профиля, обеспечивающего, во-первых, аномальную дисперсию на центральной длине волны используемого в экспериментах лазерного излучениянакачки (800 нм), во-вторых, реализацию явления СССЧ на заданной длине волны. Как толькофемтосекундный импульс начинает распространяться в подобном МС волокне, он стремится сфор-91,0.10,6.,..0,80,1,0,40,20,010,04004005006007008009005006001000700,,(а)(б)(в)Рис.

4. (а) Схема волоконно-оптической системы возбуждения и сбора флуоресцентного отклика различныхмаркеров в мозгу трансгенных мышей. Высоконелинейное ФК волокно служит для спектрального преобразования импульсов Ti:S лазера на длине волны 810 нм в излучение суперконтинуума. (б) Спектры излучениянакачки (пунктир) и суперконтинуума (сплошная линия). (в) Спектр пропускания полого ФК волокна, которое служит спектральным фильтром, передающим часть суперконтинуума для эффективного возбужденияфлуоресценции биомаркеров, но в то же время препятствующим распространению света в области флуоресценции биомаркеров.мировать солитон. В результате явления СССЧ (проявляющегося из-за эффекта комбинационногорассеяния) происходит постепенный и постоянный сдвиг в длинноволновую область центральнойдлины волны солитона. Для солитона на выходе рассмотренного типа МС волокон может бытьдостигнут диапазон перестройки длин волн шириной 600 нм (от 800 до 1400 нм), таким образомспектр солитонного импульса может быть подобран оптимальным образом под спектр двухфотонного поглощения практически любого используемого биомаркера.

В проведенных экспериментахМС волокно обеспечивало на выходе стабильный солитон с центральной длиной волны 980-990 нм(красная кривая Рис. 5(б)) идеально подходящий для эффективного двухфотонного возбуждениябелковых молекул EGFP или биологического красителя AlexaFluor 488. Спектр зарегистрированного двухфотонного отклика AlexaFluor 488 в мозге мыши представлен синим на Рис. 5(б). Врезультате было показано, что созданная световодная платформа, состоящая из МС-световодов длягенерации широкополосного излучения (суперконтинуум) и солитонного излучения, полых МСсветоводов для спектральной фильтрации, а также Ti:S осциллятора обеспечивает универсальный1,00,8.0,40,6,,0,6.0,1,....0,80,40,20,010,20,0500550600400650600800,10001200,(а)(б)Рис.