Световодные системы для нейрофотоники, страница 2

Показано, что когерентное подавление генерации третьей гармоники в жестко сфокусированных лазерных пучках позволяет осуществлять высокоточную безмаркерную визуализациюотдельных нейронов в тканях мозга; и экспериментально показана возможность комбинацииметода микроскопии генерации третьей гармоники с флуоресцентными методами микроскопии без изменения контрастности сигнала третьей гармоники.Практическая значимостьРезультаты, изложенные в диссертационной работе, могут быть использованы для cозданияновых подходов и методов многофункциональной волоконно-оптической визуализации живых объектов, что позволяет подойти к исследованию и решению фундаментальных задач биологии инейрофизиологии.3На защиту выносятся следующие основные результаты и положения:I. На основе созданной световодной платформы, состоящей из МС-световодов для генерацииширокополосного излучения (суперконтинуума) и полых МС-световодов для спектральнойфильтрации засветки, обеспечивается комплексная многочастотная оптическая регистрацияактивности нейронов головного мозга с использованием нелинейно-оптических взаимодействий и флуоресценции маркерных белков.II.

Микроструктурированные световоды с малым (несколько микрон) размером сердцевины обеспечивают существенное увеличение локальности волоконно-оптического зондирования, обеспечивая возможность регистрации оптического отклика отдельных нейронов головного мозга.Использование микроструктурированных световодов с радиусом сердцевины 1 мкм и числовой апертурой 0.38 позволяет ограничить область сбора сигнала объемом менее 50 мкм3 .III. Созданный волоконно-оптический нейроинтерфейс позволяет осуществлять регистрацию отклика флуоресцентных маркерных белков в глубоких слоях мозга живых животных при ихсвободном поведении с минимальной степенью инвазивности в течение длительного времени(до одного месяца), а также проводить одновременные измерения уровня флуоресценции изнескольких пространственно разнесенных областей мозга живого животного.IV.

Микросветоводные зондирующие системы, cостоящие из пучков оптических волокон, интегрированных с гальваносканирующими зеркалами, обеспечивают одновременную визуализацию пространственного распределения нескольких флуоресцентных маркеров в мозге живогосвобоноподвижного животного с субклеточным пространственным разрешением, а также позволяют строить изображения микрообъектов на основе регистрации комбинационного рассеяния света в режиме эндоскопии с высоким пространственным разрешением.V. Антирезонансные волоконно-оптические световоды с полой сердцевиной обеспечивают эффективное подавление фонового сигнала комбинационного рассеяния из волокна, что приводит к эффективному (более, чем на порядок) повышению чувствительности волоконно-оптической регистрации спонтанного комбинационного рассеяния по сравнению со стандартнымиволоконными световодами.Апробация работыПо материалам диссертационной работы опубликовано 28 научных работ, из них 12 статей врецензируемых научных журналах из списка ВАК России: Optics Letters, Applied Physics Letters,Applied Optics, Journal of Biophotonics и 16 статей в сборниках трудов конференций.

Основныерезультаты исследований докладывались на научных семинарах кафедры общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, а также на международныхконференциях.4Личный вклад автораСодержание диссертации и основные положения, выносимые на защиту, отражают персональный вклад автора в опубликованные работы. Подготовка к публикации полученных результатов проводилась совместно с соавторами, причем вклад диссертанта был определяющим. Всепредставленные в диссертации результаты получены лично автором.Структура и объем диссертацииДиссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения и библиографии.

Общий объем диссертации составляет 145 страниц, включая 49 рисунков. Библиография включает 156 наименованийна 15 страницах.Содержание работыВо введении обоснована актуальность диссертационной работы, сформулирована цель и аргументирована научная новизна исследований, показана практическая значимость полученных результатов, представлены выносимые на защиту научные положения.Первая глава посвящена обзору литературы в рамках поставленной задачи. В разделе 1.1рассмотрены современные методы исследования нейронной активности in vivo и обосновано, почему именно оптические методы визуализации являются наиболее востребованными при исследованиях мозга.

Рассмотрены преимущества оптической in vivo визуализации, такие как высокоепространственное и временное разрешение при сохранении большого поля зрения, возможностьисследования сразу нескольких аспектов нейронной активности (электрическая активность, входв клетку ионов кальция, экспрессия генов и производство различных белков, появление и исчезновение синапсов и т.д.) в сравнении с различными методами томографии и электорофизиологии(Рис.

1(а)). В разделе 1.2 описаны экспериментальные возможности оптической визуализации нейронной активности живых бодрствующих животных и показано, что оптические волокна становятся ключевыми компонентами оптических биосенсоров и визуализирующих устройств, благодарясвоей гибкости, компактности и возможности сочетать различные функции. В разделе 1.3 описанысвойства и преимущества микроструктурированных (МС) световодов в контексте задач оптического зондирования, а также представлены и описаны различные типы оптических волоконных зондов.В завершающем главу разделе 1.4 описаны возможности безмаркерной оптической визуализации,такие как методы комбинационного рассеяния света и генерация оптических гармоник (Рис.

1(б)).Во второй главе приведено описание экспериментальной аппаратуры и методик измерений,использованных при проведении представленных в настоящей диссертации исследований. В разделе 2.1 подробно описаны использованные в работе лазерные источники, такие как твердотельныенепрерывные лазеры, а также фемтосекундные лазерные генераторы на кристаллах Cr:Forsterite иTi:Sapphire и области их применения.

В разделе 2.2 дано описание различных типов оптическихсветоводов, включающих в себя стандартные телекоммуникационные волокна с диаметром сердцевины 9 или 50 мкм, различные типы микроструктурированных световодов, в том числе полые5фМРТМЭГПЭТ1лонкаh3whwМикроповреждения0hwpМультиэлектроднаярегистрацияСлой -1НейронhwshwphwasМикроэлектродная регистрация-2ДендритЛокальная фиксация потенциала-3СинапсhwПовреждения2Логарифмический размер мм)hw3Оптические методы-4hwh2whw-4-3 -2 -1Милисекунды01234Секунды Минуты Часы56ДниЛогарифмическое время с)(а)(б)Рис. 1. (а) Сравнение пространственного и временного разрешений различных методов исследования работымозга in vivo, (б) Схематичное изображение нейрона как сложной системы, обладающей набором нелинейнооптических свойств, развитие методик визуализации которых позволит получать дополнительную информацию о структуре, свойствах и активности клеток.антирезонансные волноводы, а также пучки волокон (6000 световодов с диаметром сердцевиныотдельного волокна 2.4 мкм, расстоянием между ними 3.2 мкм).

Раздел 2.3 посвящен описаниюметодов прижизненного маркирования нейронной активности. Маркерные системы, основанные наорганических белках, обычно состоят из двух частей: это «сенсор» – белок, который испытываетструктурные изменения, зависящие от исследуемых параметров (таких как мембранный потенциал,вход ионов в клетку, экспрессия генов) и «маркер» – флуоресцентный белок, оптический откликкоторого модулирован изменениями сенсорного белка. Для маркирования широко используется линейка красителей Alexa Fluor, а также флуоресцентные белки EGFP и DsRed2.

Ген EGFP можетбыть встроен в геном организма, а именно в ту область ДНК, которая кодирует белок интереса.Таким образом, в тех клетках, в которых экспрессируется ген белка интереса и этот белок начинает продуцироваться, одновременно начинает продуцироваться и белок EGFP, который может бытьзарегистрирован по флуоресценции. Это дает возможность визуализировать геномную активностьнейронов.В третьей и четвертой главах изложены оригинальные результаты.

Третья глава посвященаисследованию и оптимизации световодных систем для визуализации нейронной активности живыхживотных. В разделе 3.1 проведено исследование и подбор параметров оптических зондов дляразличных задач. Был произведен теоретический расчет свойств волоконно-оптического зондирования, таких как чувствительность, геометрия области эффективно сбора сигнала, продольное ипоперечное разрешение, исходя из известных параметров волокна и исследуемой системы.

Затемтеоретическая модель сравнивалась с результатами экспериментов, проведенных на микрочастицах, прокрашенных красителем родамин 6ж. Оптическое возбуждение осуществлялось излучениемвторой гармоники непрерывного Nd:YAG лазера на длине волны 473 нм. Геометрия возбуждения6и сбора флуоресцентного отклика представлена на Рис. 2(а).

Пример экспериментально измеренной области сбора сигнала МС волокном с радиусом сердцевины 1 мкм представлен на Рис. 2(б).Было показано, что предложенная теоретическая модель полностью совпадает с экспериментальными данными (Рис. 2(в) точки – экспериментальные данные, линии – теоретическая модель для(1) стандартного и (2) МС световодов).aclada0eramq div(а)(б)(в)(г)Рис. 2. (а)-(в) Волоконное зондирование флуоресцентно прокрашенных микрочастиц.

(а) Схема эксперимента: acore – радиус сердцевины, am – эффективный радиус моды, θdiv – угол расхождения излучения, ~ez ,~er – продольный и поперечный единичные вектора. (б) xz-карты флуоресцентного отклика, измеренные спомощью МС волокна с a ≈ 1 мкм и NA ≈ 0.38 (в) Собранная мощность флуоресценции, измеренная какфункция расстояния z, используя (1) стандартное волокно и (2) ФК волокно (точки) в сравнении с теоретической моделью (сплошные линии). (г) Мощность флуоресцентного сигнала, собранного волоконным зондом,как функция эффективного радиуса моды am и числовой апертуры NA, для постоянной интенсивности излучения доставляемой по волокну.

Сплошные линии показывают изолинии постоянного объема оптическогозондирования. Объем тела нейрона показан штриховой линией.Таким образом, было экспериментально показано, что МС волокна с малым размером сердцевины увеличивают локальность оптического зондирования в волоконно-оптических форматах визуализации (Рис.

2(б)). Было продемонстрировано, что используемое в экспериментах МС волокнос радиусом сердцевины 1 мкм и числовой апертурой 0.38 ограничивает зондирование в областиобъемом меньше 50 мкм3 , позволяя тем самым оптический опрос с субклеточным разрешением.На основе предложенной теоретической модели были даны рекомендации по выбору оптимального волоконного зонда для различных задач. На Рис.