Световодные системы для нейрофотоники

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙУНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ M.В.ЛОМОНОСОВА»На правах рукописиАмитонова Любовь ВладимировнаСветоводные системы для нейрофотоники01.04.21 – Лазерная физикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква – 2013Работа выполнена на кафедре общей физики и волновых процессов физического факультетаМосковского государственного университета имени М.В.Ломоносова.Научный руководитель:д.ф.-м.н, профессорЖелтиков Алексей МихайловичМосковскийгосударственныйуниверситетимениМ.В.Ломоносова, МоскваОфициальные оппоненты:д.ф.-м.н, профессорГончуков Сергей АлександровичНациональный исследовательский ядерный университет«МИФИ», Москвад.ф.-м.н, профессорЛощенов Виктор БорисовичФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей физики им.

А.М. Прохорова Российскойакадемии наук, МоскваВедущая организация:Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр фотохимии Российской академии наук (ЦФ РАН),МоскваЗащита состоится « 06 »июня2013 г. в 15:00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.31при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова, по адресу: 119991 ГСП-1Москва, Ленинские горы, МГУ, улица Академика Хохлова, дом 1, стр. 62, Корпус нелинейной оптики, аудитория имени С.А. Ахманова.С диссертацией можно ознакомиться в отделе диссертаций научной библиотеки Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (Ломоносовский просп., д.27).Автореферат разослан « 23 » апреля 2013 г.Отзывы и замечания по автореферату в двух экземплярах, заверенные печатью, просьба высылатьпо вышеуказанному адресу на имя ученого секретаря диссертационного совета.Ученый секретарьдиссертационного совета,к.ф.-м.н.Коновко А. А.Общая характеристика работыАктуальность работыОптические методы являются одними из наиболее перспективных направлений проведениядиагностики и измерений в биологии и биомедицинских приложениях.

Оптическая визуализациярасполагает непревзойденными возможностями, которые включают в себя целый ряд методов: визуализацию флуоресцентных биомаркеров, методы химически селективной визуализации за счетэффектов спонтанного и когерентного комбинационного рассеяния света и методы нелинейно-оптической микроскопии, такие как микроскопия двухфотонного поглощения, микроскопия генерациивторой и третьей гармоники.Возможность изучать живые системы на протяжении длительного времени является ключевойдля многих биологических исследований, поэтому методы оптической регистрации, адаптированные для долговременных экспериментов над живыми бодрствующими животными, сейчас наиболеевостребованы. Работа с живыми объектами, in vivo, накладывает особые требования к устройствамвизуализации в отношении их гибкости, компактности, механической прочности и необходимостиобъединять разнообразные функциональные задачи, такие как обеспечение оптимальной геометриилокального возбуждения биомолекул, эффективный сбор оптического отклика, доставка сигналов сминимальными потерями и возможности визуализировать различные аспекты биологических процессов.

Отдельной проблемой является визуализация глубоких слоев мозга живого животного. Дляметодов двухфотонной микроскопии глубина визуализации не может превышать 1 мм или 1.5 ммв случае использования специальных маркеров и микроскопных систем, что позволяет in vivo исследовать только кору головного мозга.Компактный размер, механическая гибкость и все более растущая функциональность волоконно-оптических устройств в сочетании с последними разработками флуоресцентных маркеровдля разнообразных клеточных процессов обеспечивают новые возможности для in vivo функциональной визуализации в биологических задачах. Таким образом волоконно-оптические зонды становятся ключевыми компонентами оптических сенсорных систем.В первых работах по волоконно-оптическому получению изображений живой ткани былапродемонстрирована возможность использования пучков оптических волокон для визуализациивнутренних функциональных сигналов в глубоких слоях мозга свободноподвижных кошек.

Хотяизображение получалось плохого качества и с низким разрешением, идея использовать оптическиеволокна для изучения бодрствующих животных продолжила развиваться и была позднее применена к живым мышам. В этих работах оптическое волокно использовалось лишь в течение короткоговремени и либо как отдельный точечный зонд, который регистрирует, но не визуализирует характеристики ткани либо в устройствах не обеспечивающих клеточного разрешения. До сих пор методыволоконно-оптической визуализации подразумевали работу только с одним флуоресцентным биомаркером и не были адаптированы для задач нелинейно-оптической микроскопии и микроскопиикомбинационного рассеяния света.

Таким образом, существующие волоконно-оптические системывизуализации обладают рядом существенных ограничений.1Цель диссертационной работы состоит в исследовании линейных и нелинейных оптическихявлений в контексте задач биовизуализации и разработке световодных систем для оптическогозондирования тканей мозга живых бодрствующих животных.Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:I. Исследование и оптимизация параметров световодных зондов для эффективного сбора некогерентного флуоресцентного отклика с высоким пространственным разрешением.II. Разработка и экспериментальная реализация волоконно-оптического формата визуализациипространственного распределения одновременно нескольких флуоресцентных маркеров в мозгеживого свободноподвижного животного с субклеточным разрешением.III.

Исследование и разработка методов для реализации полностью волоконной системы длямногокомпонентного линейного и нелинейного оптического зондирования набора биомаркеров набазе микроструктурированных волокон.IV. Разработка и экспериментальная реализация волоконно-оптического нейроинтерфейса дляминимально инвазивного измерения уровня экспрессии флуоресцентных маркерных белков в глубоких слоях мозга живых животных в течение длительного времени одновременно из несколькихпространственно разнесенных структур мозга живого животного.V. Разработка и экспериментальная реализация безмаркерной волоконно-оптической визуализации пространственного распределения веществ и структур с комбинационно активными линиямив режиме эндоскопии.VI. Исследование и экспериментальная реализация возможностей увеличения чувствительности эндоскопного формата регистрации спонтанного комбинационного рассеяния.VII.

Исследование и экспериментальная реализация возможностей безмаркерной визуализации нервных тканей с помощью микроскопии генерации третьей гармоники и последующих возможностей комбинации данного метода с флуоресцентной микроскопией.Научная новизнаI. Микроструктурированные (МС) волокна с малым размером сердцевины увеличивают локальность оптического зондирования в случае волоконно-оптического формата визуализации.Экспериментально показано, что МС волокно с радиусом сердцевины ≈ 1 мкм и числовойапертурой 0.38 может ограничивать оптическое зондирование в области объемом меньше чем50 мкм3 , позволяя оптический опрос отдельных нейронов в рамках типичного экспериментапо визуализации мозга.II. Оптоволоконный микрозонд, состоящий из ≈ 6000 волокон с диаметром сердцевины каждогоотдельного волокна 2.4 мкм, соединенный с конфокальным оптическим микроскопом позволяет in vivo визуализировать пространственное распределение одновременно несколькихфлуоресцентных маркеров в мозге живого свободноподвижного животного с субклеточнымразрешением равным 3 мкм.2III.

Микроструктурированные волокна, в которых генерируется широкополосное излучение суперконтинуум с широким спектром от 420 до 1000 нм, могут быть интегрированы с волоконными спектральными фильтрами на основе полых антирезонансных световодов для реализации многоцветного возбуждения и регистрации одновременно нескольких флуоресцентныхмаркеров.IV.

Микроструктурированное волокно со сконструированным должным образом профилем дисперсии обеспечивает плавную перестройку излучения от 800 до 1400 нм и позволяет точноподобрать длину волны солитона на выходе волокна к спектру двухфотонного поглощениялюбого флуоресцентного биомаркера, усиливая таким образом отклик двухфотонной флуоресценции, что может быть использовано для нелинейно-оптического зондирования в волоконном формате.V. Разработан волоконно-оптический нейроинтерфейс, который, как было экспериментально показано, позволяет минимально инвазивно проводить измерения уровня экспрессии флуоресцентных маркерных белков в глубоких слоях мозга живых животных в течение длительноговремени (до одного месяца) при их свободном поведении во время и после разнообразныхфизиологических и фармакологических воздействий, а также позволяет проводить измеренияуровня флуоресценции одновременно из нескольких пространственно разнесенных структурмозга живого животного.VI.

Пространственное распределение веществ с комбинационно активными линиями может бытьвизуализировано в волоконном формате в режиме эндоскопии с разрешением 3 мкм методомрегистрации спонтанного комбинационного рассеяния света.VII. Антирезонансные волокна с полой сердцевиной позволяют увеличить до 17 раз чувствительность волоконно-оптической регистрации комбинационного рассеяния по сравнению состандартными световодами.VIII.