Световодные системы для нейрофотоники, страница 4

5. Флуоресцентные отклики (а) красителей EGFP и Alexa Fluor 594 измеренные одновременно в мозгемыши с помощью световодной платформы, (б) красителя AlexaFluor 488 (синяя кривая), возбужденногоДФП сдвинутого по частоте солитона на выходе из высоко нелинейного МС волокна (окрасная кривая).Штрихпунктирная линия - спектр лазерного импульса.10источник видимого и ближнего ИК излучения для комплексной многочастотной оптической регистрация практически любых флуоресцентных меток как в линейном, так и в нелинейном режимах.Таким образом, как описано выше, были исследованы возможности и методы оптимизациикак самих волоконных зондов, так и универсальных источников излучения, максимально совместимых с волоконными технологиями. Еще одним, безусловно важным, звеном в системе зондирования нейронной активности живых животных является интерфейс между изучаемым мозгоми самим зондом, который, в случае простого вживления оптоволокна, обладает рядом существенных недостатков, не позволяя проводить долговременные исследования, хотя возможность изучатьживые системы на протяжении длительного времени является ключевой для многих задач.

В разделе 3.5 описан разработанный в диссертационной работе метод, позволяющий проводить измеренияуровня флуоресценции глубоких слоев мозга живых животных при их свободном поведении во время и после обучения, который принципиально рассчитан на длительные, в масштабах несколькихнедель, измерения нейронной активности. Специальный коннектор и двух этапный метод крепления оптоволокна дают возможность проводить долговременный ряд экспериментов на одном и томже животном в любой структуре мозга и при этом сохранять уверенность в получении сигнала отодной и той же группы клеток (схема эксперимента и разработанного интерфейса представлена наРис.

6(а)). При этом благодаря максимально легкому и компактному размеру вживляемой системывсе время между измерениями животные могут жить в своих домашних клетках без дополнительных неудобств, а также без опасности повредить оптоволокно.(а).Рис. 6. Долговременное зондирование флуоресцентных маркеров в глубоких слоях мозга живых свободноподвижных животных с помощью разработанного волоконно-оптического нейроинтерфейса.

(а) Экспериментальная схема. (б-в) Экспериментальные результаты для CA1 области гиппокампа: (б) сравнение динамикуровня экспрессии EGFP для мыши подверженной световой депривации (красные точки) и контрольной мыши, содержавшейся в стандартных условиях (оранжевые точки) на протяжении 4-х дней. (в) зависимостиуровня экспрессии EGFP от времени в течение 4-х часов после электрокожной стимуляции (красные точки)и после введения судорожного агента (синие точки).

Момент стимуляции отмечен стрелкой.11Было экспериментально показано, что разработанный метод позволяет проводить измерениянейронной активности в различных временных масштабах: (1) в течении нескольких дней, результаты этих экспериментов представлены на Рис. 6(б), для животных находившихся в стандартныхусловиях (оранжевая кривая) и подвергающихся световой депривации (красная кривая). Видно, чтов случае депривации уровень геномной активности нервных клеток равномерно спадает со временем на протяжении 4-х дней.

(2) в течение нескольких часов, результаты этих экспериментов представлены на Рис. 6(в). Регистрировались измерения экспрессии генов в ответ на электрокожнуюстимуляцию (красный цвет) и в ответ на внутрибрюшинное введение судорожных агентов (синийцвет). Видно, что эти воздействия приводят к росту геномной активности.

(3) С другой стороны,данный метод обладает достаточным временным разрешением (миллисекунды) для регистрациитаких быстрых процессов, как изменение кальциевых токов.Предложенный волоконно-оптический метод за счет гибкости и компактности вживляемыхдеталей позволил впервые продемонстрировать оптическую регистрацию отклика одновременнодвух разных пространственно разнесенных глубоколежащих структур головного мозга живых свободноподвижных животных.

На Рис. 7 представлены фотографии экспериментальных животныхсо вживленными коннекторами в свободном поведении без волокон (а) и во время экспериментовс подсоединенными волокнами для доставки и сбора сигнала (б). Экспериментально измеренныегеномные отклики нейронной активности одновременно из двух полушарий соматосенсорной коры в ответ на стимуляцию вибрисс с одной (правой) стороны головы представлены на Рис.

7(в).Как и ожидалось, геномная активность увеличивается только в контрлатеральном по отношению кстимулу полушарии (в нашем случае левом) - красная линия Рис. 7(в).1,20.1,10,.1,151,051,000,95020406080100120,(а)(б)(в)Рис. 7. Регистрация оптического отклика одновременно от двух разных пространственно разнесенных глубоколежащих структур головного мозга живых свободноподвижных животных.

(а-б) Фотографии экспериментальных мышей со вживленными нейроинтерфейсами (а) без волокон и (б) с подсоединенными волокнами.(в) Результаты измерений геномного отклика нейронов одновременно в двух полушариях соматосенсорнойкоры после стимуляции вибрисс с одной стороны головы. Видно, что активность возрастает только в контрлатеральном по отношению к стимулу полушарии (красная кривая).12В четвертой главе диссертационной работы исследуются возможности безмаркерной оптической визуализации. Известно, что микроскопия комбинационного рассеяния света открываетуникальные возможности химически селективной визуализации различных веществ без необходимости использования дополнительных флуоресцентных маркеров. В разделе 4.1 показано, чтосочетание метода микроскопии спонтанного комбинационного рассеяния света с волоконным форматом доставки и сбора сигнала может обеспечить бо́льшее удобство использования, удаленныйдоступ, а также возможности для in vivo исследований при сохранении безмаркерного получения изображений с высоким пространственным разрешением.

В проведенных экспериментах быловпервые показано, что использование пучков оптоволокон в сочетании с системой сканирования иоптической схемой для регистрации линий спонтанного рамановского рассеяния на входном торцеволокна позволяет в формате эндоскопа визуализировать с высоким пространственным разрешением структуры и распределение различных веществ по их комбинационно-активными линиям.1,0,..0,80,60,40,20,010001500200025003000-1,(а)(б)Рис.

8. (а) Схема эксперимента по волоконно-оптической визуализации пространственного распределениявеществ по их комбинационно-активным линиям с помощью пучка волокон. (б) Нормированные спектрыкомбинационного рассеяния волокна, используемого в качестве зонда для визуализации (синяя линия), полистирольной пластинки (черная линия) и алмазных наночастиц (красная линия).Схема эксперимента представлена на Рисунке 8(а).

С помощью двух гальваносканирующихзеркал и объектива непрерывное излучение второй гармоники Nd:YAG лазера на длине волны 532нм последовательно фокусировалось в различные точки на переднем торце волоконного зонда, состоящего из нескольких тысяч волокон, с шагом 0.5 мкм и таким образом заводилось в различныеволокна данного микрозонда. Главной трудностью в случае регистрации спонтанного комбинационного рассеяния света является низкий уровень сигнала, что до сих пор серьезно ограничиваловозможности волоконно-оптической визуализации. Для повышения чувствительности предложенного метода сбор некогерентного рамановского отклика осуществлялся с использованием одновременно всех волокон в пучке (около 6000 шт.), таким образом обеспечивая достаточно большуюплощадь и апертуру сбора при сохранении высокого пространственного разрешения.

Карта рамановского отклика строилась попиксельно путем повторения данных измерений для каждого волокна в пучке.13На Рис. 8 (б) синим цветом представлен отклик комбинационного рассеяния используемоговолокна, который ограничивает визуализируемые рамановские линии в области от 1250 см−1 . Вкачестве экспериментальных образцов были выбраны алмаз и полистирол, так как они представляют собой примеры комбинационно-активных систем с заметно различающимися рамановскимиспектрами (Рис. 8 (б) красная и черная линии) и, таким образом, позволяют максимально хорошо продемонстрировать возможности реализованной системы. На Рис.

9 представлены результатыэкспериментов по рамановской волоконной визуализации различных веществ в формате эндоскопии: (а) полистирольная пластина с царапиной, (б) кластеры алмазных наночастиц, (в) алмазныенаночастицы распределенные по поверхности стекла в виде буквы «А».(а)(б)(в)Рис. 9. Карты рамановского отклика: (а) полистирольной пластинки с царапинами (б) наноалмазных кластеров и (в) распределения алмазных наночастиц на поверхности стекла, образующего форму буквы «А»,визуализированные с помощью оптоволоконного зонда. Шкала (а) 10 мкм, (б-в) 20 мкм.Таким образом, была экспериментально продемонстрирована возможность визуализироватьраспределение веществ по их рамановским линиям в эндоскопном формате с пространственнымразрешением около 3 мкм.

Однако, видно, что в случае волоконных методов зондирования встречаются серьезные трудности, относящиеся к рамановскому фону, присущему материалу, из которогоизготовлен волоконный зонд (Рис. 8 (б)), что уменьшает чувствительность волоконно-оптическогорамановского зондирования. В разделе 4.2 было показано, что оптические волокна в сочетании сподходящей математической процедурой выделения спектральных рамановских линий могут бытьиспользованы для регистрации характерной симметричной моды колебаний растяжения CH2 -связив тканях мозга, а также алкиновой группы характерных маркеров пролиферации клеток EdU.

Однако, дальнейшее повышение чувствительности волоконно-оптических методов зондирования ивизуализации комбинационного рассеяния является актуальной задачей.В разделе 4.3 было показано, что решение этой проблемы может быть адресовано к должнымобразом сконструированным полым волноводам (вставка на Рис. 10(а)). Полые антирезонансныеволокна имеют достаточно широкую полосу пропускания, позволяя осуществлять накачку и захватывать отстроенный рамановский отклик сердцевиной. На Рис. 10 представлены спектры маркерапролиферации клеток EdU измеренные через полое антирезонансное (б) и стандартное телекоммуникационное (в) волокна одинаковой длины.

В обоих случаях удалось зарегистрировать сигнал, однако разница в свойствах фона оказывается поразительной. В случае кварцевого волокна14основным источником фона является рамановский фон волокна, тогда как в случае полого волокна доминирующей частью фона становится уже флуоресценция самого исследуемого образца,что значительно повышает соотношение сигнал/шум. В работе было экспериментально показано,что антирезонансные волокна с полой сердцевиной позволяют увеличить до 17 раз чувствительность волоконно оптической регистрации маркеров пролиферации клеток с помощью спонтанногокомбинационного рассеяния по сравнению со стандартными световодами, тем самым радикальноповышая чувствительность зондирования синтеза ДНК в живых клетках и представляя мощныйинструмент для волоконно-оптической визуализации бодрствующих животных.1,265.1,0...1,14,,320,10100,150,050,002040 2060 2080 2100 2120 2140 2160 21802040206020802100212021402160-12180,-1,(а)(б)(в)Рис.