Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком, страница 9

Результаты,полученные выше, относятся к случаю параллельного расположения фрагмента ДНК ивектора градиента скорости течения, при котором величина растягивающего усилияимеет максимум, так как градиент скорости течения в данной модели являетсяпродольным, то есть сонаправлен с вектором скорости течения в любой точкежидкости. Стоит отметить, что в данной модели цепь полимера изначально являетсяпрямолинейной.

Так как персистентная длина молекулы ДНК составляет величинупорядка 150 пар оснований (см. раздел 1.2 Главы 1.), то для фрагмента длиной около300 пар оснований такое приближение не совсем оправдано. Тем не менее, в случаевысоких градиентов течения, имеющих место вблизи схлопывающихся кавитационныхпузырьков, растяжение полимера, очевидно, приводит к его «линеаризации».Структура течения также способствует «выравниванию» фрагментов вдоль вектораскорости течения жидкости.54Сила растяжения модельной системы также существенным образом зависит оттаких параметров модели, как вязкость жидкости, жесткость сегментов и количествозвеньев в цепи. Вязкость жидкости в модели соответствовала вязкости воды притемпературе 0 оС: μ=1,7 мПа, а константа жесткости, k=6000 пкН – получена припомощи моделирования растяжения коротких фрагментов ДНК в рамках молекулярнодинамического подхода (неопубликованные результаты), и принимает промежуточноезначение по отношению к экспериментальным данным по растяжению единичныхмолекул ДНК (см.

раздел 1.2 Главы 1) (k≈1000 пкН ) [Bustamante et al, 1994] иэкспериментальным данным по определению скорости звука в ДНК (k≈8000 пкН)[Hakim et al, 1984]. Важно отметить, что полученные значения растягивающего усилия,действующего в центральной части фрагмента и составляющего при G > 108 с-1величину в несколько тысяч пиконьютонов могут приводить к значительномуизменению конформации полимера. В экспериментах по растяжению единичныхмолекул ДНК [Smith et al, 1996] конформационный переход ДНК из B в S – формупроисходил уже при 70 пкН. Однако, в описанных экспериментах (см. раздел 1.2)процесс растяжения характеризовался временами порядка десятков секунд, в то времякак растяжение фрагментов ДНК под действием акустической кавитации, всоответствии с полученными результатами, происходит на временах порядка десяткананосекунд.

Переход ДНК в S-форму, сопровождающийся резким изменением длинымолекулы более чем в полтора раза в таком случае может быть затруднен из-за наличиямножества связанных с ДНК молекул растворителя. Модель, предлагаемая в четвертойглаве диссертации строится на предположении, что фрагмент ДНК все же непретерпевает серьезных конформационных переходов в процессе взаимодействия свысокоградиентным течением жидкости.3.3. Моделирование кинетики расщепления фрагментов ДНК под действиемакустической кавитации.Как известно, наличие механического напряжения в молекуле может привести кееразрыву.механическимХимическаявоздействием,реакциядиссоциацииявляетсячастныммолекулы,случаемкатализируемаятакназываемыхмеханохимических реакций. Кинетика механохимических реакций, как правило,55описывается в рамках теории активированного комплекса или же эмпирическимуравнением, схожим с уравнением Аррениуса.В соответствии с модифицированной теорией активированного комплекса,скорость механохимической реакции в случае наличия «катализирующего» реакциюусилия f может быть выражена следующим образом [Schmidt et al, 2008]:ESfkTkkTkр e e2 (3.5),где kр – скорость реакции, k- постоянная Больцмана, T – абсолютная температура,  постоянная Планка, ∆S – изменение энтропии при образовании активированногокомплекса, ∆Ef - энергетический барьер образования активированного комплекса приналичии усилия f (энергия активации):∆Ef =E* - E0 – f .∆x(3.6),где E* - энергия активированного комплекса, E0 – энергия основного состояния(начальная энергия реагентов),f – проекция внешней силы на направление,соответствующее условной координате реакции ( в случае реакции диссоциации илигидролиза это направление совпадает с направлением ковалентной связи), .∆x –изменениеусловнойкоординатыреакцииприобразованииактивированногокомплекса.В случае реакции гидролиза фосфодиэфирной связи сахарофосфатного остова ДНКвеличина активационного барьера ∆E* в отсутствии внешней силы составляет величинуоколо 26 ккал/моль, а энтропийный барьер – около 34 кал/( K.

моль). Таким образом,скорость гидролиза ДНК по С3‟–О3‟ связи при нормальных условиях составляетвеличину порядка k0=2 . 10-13 с-1.При наличии растягивающего усилия F, скорость реакции, в соответствии суравнениями (3.5) и (3.6) может быть записана в виде:k f  k0 efxkT(3.7),56где f – величина силы, действующей на растяжение ковалентной связи С3‟-O3‟, котораязависит от распределения «нагрузки» F по степеням свободы молекулы, - то есть в томчисле от ориентации связи по отношению к направлению действия растягивающейсилы F.

Величина .∆x представляет изменение длины ковалентной связи, необходимойдля гидролиза связи. Предполагая, что основную часть активационного барьерареакции гидролиза фосфодиэфирной связи составляет энергия, необходимая длядостаточной «деформации» ковалентной связи С3‟-O3‟, величину.∆x можноопределить из условия:Vm(.∆x)= ∆E*(3.8),где Vm(.∆x) – потенциал Морзе, описывающий деформацию ковалентной связи С3‟-O3‟[Basedow et al, 1977]: Vm(.∆x)=D (1 – e-β∆x)2,для которого D=83 ккал/моль, β=2.58 Ǻ-1. Из уравнения (3.8) следует, что величина .∆xсоставляет около 0.3 Ǻ.При помощи полученных соотношений можно оценить долю разорванныхфрагментов ДНК за один цикл схлопывания кавитационного пузырька: результатымоделирования, полученные в разделах 3.1 и 3.2, могут быть объединены с цельюрасчета кинетики расщепления ДНК на второй стадии схлопывания кавитационногопузырька.Пусть в некоторый момент времени t стадии схлопывания градиент скороститечения жидкости в окружающем пузырек пространстве описывается функцией G(r,t).Если концентрацию фрагментов ДНК n(r,t) считать постоянной величиной n(r,t)=n0, тов сферическом слое радиуса r и толщины dr будет находится 4πr2dr n0 фрагментовДНК.

Считая, что некоторая их часть β ориентирована по скорости течения, можноопределить действующую на эти фрагменты со стороны жидкости растягивающуюсилу F, которая зависит от величины градиента скорости скорости течения G(r,t), тоесть F(G(r,t)). Здесь под F понимается сила растяжения, действующая в центрефрагмента ДНК.

Общая сила растяжения F распределяется по степеням свободымолекулы и частично передается на каждую фосфодиэфирную связь, увеличиваявероятность ее гидролиза. Таким образом, за время dt гидролиз определеннойфосфодиэфирной связи в центральной части фрагмента произойдет в среднем вdN= β 4πr2dr n0 kf dt57фрагментах ДНК, где под kfпонимается скорость механохимической реакциигидролиза, которая определяется в соответствии с уравнением (3.7).

Существеннымпунктом в данной модели является переход от общей силы растяженияF к еесоставляющей f, действующей на уровне фосфодиэфирной связи C3‟-O3‟:f=γF(3.9),где γ – эффективный множитель, далее называемый трансмиссионным коэффициентом.Как видно из (3.9), данный множитель характеризует долю растягивающего усилия f,приходящегося на фосфодиэфирную связь, по отношению к величине суммарногонатяжения F.

Так как сахарофосфатный остов ДНК состоит из двух цепей, то γ≤0.5.Суммируя, доля разорванных фрагментов ДНК на определенной стадии схлопыванияможет быть выражена следующим образом: 4r n  k eF ( G ( r ,t ))20kотн kT0dtdrt ,r(3.10), 4r n dr20rгде интегрирование ведется по соответствующему промежутку времени, а для каждогомомента времени t интегрирование ведется по диапазону R(t)≤r≤Rmax , гдеR(t) – радиус кавитационного пузырька в момент времени t, а Rmax = R(t)+∆R. Параметр∆R был принят равным 50 микрони имеет смысл ограничения диапазонаинтегрирования в силу быстрого уменьшения величины градиента скорости течения сростом расстояния r от центра пузырька (см.

уравнение 3.2).Для расчета величины kотн использовались результаты моделирования динамикикавитационногопузырька.Рассматривалсявременнойпромежутокпродолжительностью 80 нс, соответствующий второй стадии схлопывания (см. Рис.3.4). Как уже было отмечено, значения G(r,t) вычислялись при помощи соотношения(3.2). Зависимость F(G), полученная в разделе 3.2 и приведенная на Рис. 3.4. былаапроксимирована полиномом четвертой степени методом наименьших квадратов.Интеграл (3.10) вычислялся прямым суммированием с шагом по времени ∆t=10-10 c ишагом ∆r=10-7 м по параметру r.Ниже приведены результаты расчетов величины kотн для различных значений γ.График, представленный на Рис.3.9, получен для β=1.

Приведенные величины для kотн58соответствуют вероятности разрыва фосфодиэфирной связи в центральной частифрагмента ДНК за секунду, то есть за 22000 цикла схлопывания.Рис. 3.9. Зависимость доли расщепленных фрагментов ДНК kотн в пересчете на 1секунду ( то есть 22000 эффективных циклов схлопывания кавитационного пузырька)от значения трансмиссионного коэффициента γ .Экспериментальноезначениеусредненнойвероятностиультразвуковогорасщепления фрагмента ДНК длиной 312 пар оснований за секунду было получено припомощи анализа данных электрофореза и составляет величину порядка 10 -5. Такимобразом, теоретические результаты для γ=0.4соответствуют экспериментальнымданным, если предположить, что вероятность образования кавитационного пузырька зацикл разряжения ультразвуковой волны составляет величину порядка 10 -2 – то естьконцентрация зародышей кавитации составляет величину порядка 103 мл-1.Данные расчетов, приведенные на Рис.3.9., можно также сравнить сэкспериментальными данным по ультразвуковому расщеплению фрагментов ДНК,содержащих изначальный разрыв по одной из цепей.