Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком, страница 6

Гель разбит на тричасти, в каждой из которых дорожки соответствуют расщеплению фрагментов ДНКопределенной длины. Слева приведены дорожки, отвечающие расщеплению самогодлинного фрагмента ДНК – длиной 311 пар оснований (дорожки 1-6), в центре –дорожки 7-12 – расщепление фрагмента средней длины (251 п.о.) и справа – данные порасщеплениюкороткогофрагмента(216пароснований)–дорожки13-17.Последовательность нуклеотидов короткого фрагмента также содержится в среднем идлинном фрагментах, а последовательность среднего фрагмента – в длинномфрагменте.

Видно, что при увеличении длительности облучения ультразвуком от двухдо 16 минут для всех фрагментов наблюдается значительное увеличение общего уровнярасщепления ДНК.30Рис.2.2Изображениеполученноговгеля,результатеэлектрофорезаоблученныхультразвуком меченых фрагментовДНК различной начальной длины.Дорожки2-6 соответствуютоблучению двунитевых фрагментовДНК длиной 311 пар оснований приразличныхДорожкивременах7-12облучения.соответствуютоблучению фрагментов длиной в 251пару оснований, а дорожки 13-17 –облучению фрагментов длиной 216нуклеотидных пар. Дорожки 1 и 18соответствуютхимическомурасщеплению фрагментов ДНК попуринам.31Каждая полоса на геле соответствует фрагментам ДНК определенной длины,образованным в результате разрыва первоначального фрагмента по соответствующейфосфодиэфирной связи.

Интенсивность засветки изображения полосы на экране, тоестьстепеньее«почернения»,считаетсяпропорциональнойконцентрациисоответствующих фрагментов.Из рисунка видно, что добавление тиомочевины не оказывает значимоговлияния на картину расщепления ( см. Дорожки 11 и 12). Также не оказывает видимоговлияния добавление других скевенджеров активных радикалов (то есть соединений,блокирующих действие активных радикалов) - аскорбата натрия и дитиотреитола(данные не приведены). Напротив, добавление 50% глицерина, приводящее кувеличению вязкости раствора, приводит к резкому увеличению уровня расщепления(дорожки 3,8 и 14). Дорожки, соответствующие расщеплению ДНК при добавленииглицерина, выглядят также, как дорожки без глицерина, соответствующие болеедлительному времени облучения.

Таким образом, увеличение вязкости раствораприводит к увеличению общей степени расщепления ДНК, оставляя неизменнымиотносительные частоты расщепления. Этот эффект является одним из характерныхпризнаков механохимических реакций.Рисунок 2.2 также демонстрирует позиционный эффект расщепления – то естьослабление степени расщепления ДНК к концам фрагментов. Эта важная особенностьультразвуковогорасщепленияДНКтакжеявляетсяхарактернымпризнакоммеханохимической природы наблюдаемого расщепления.

Следует отметить, чтосущественная величина позиционного эффекта, а также малое влияние добавленияскевенжеров активных радикалов на наблюдаемые картины расщепления, позволяютзаключить, что расщепление ДНК, связанное с действием активных радикалов, вописанных экспериментах пренебрежимо мало.На Рисунке 2.3 представлены результаты компьютерной обработки геля,изображенного на Рис.2.2. Здесь приводятся профили интенсивностей расщепления I,полученные для нескольких полос геля. Профили относительных частот расщепленияR, расчитанные для двух полос, демонстрируют результат нормализации профилейинтенсивности.Величиныотносительныхчастотрасщепления,атакжепоследовательность пар оснований фрагмента представляют входные данные длястатистического анализа специфичности ультразвукового расщепления ДНК кнуклеотидной последовательности.32Рис.2.3.

Профили ультразвукового расщепления, полученные в результате обработкиуказанных дорожек на геле, приведенном на Рис 2.2. Высота столбца пропорциональнаконцентрации соответствующих ему фрагментов ДНК, а его цвет – типунуклеотида, за которым происходит разрыв (в направлении от 5’ к 3’ концу цепи,содержащей метку). Нижние диаграммы получены путем нормализации начальныхданных с целью устранения позиционного эффекта, наблюдаемого на первых трехдиаграммах.332.3. Статистический анализ специфичности расщепления ДНК ультразвукомБыли проанализированы картины расщепления 48 различных радио-меченныхфрагментов ДНК, имеющих длины от 150 до 500 пар оснований. Для статистическогоанализа использовались центральные части гелей, в которых полосы были четкоразделены.

Так как эксперименты по облучению фрагментов одной и той жепоследовательности демонстрировали некоторый разброс данных, они проводилисьнесколько раз. Следует отметить, что максимальные и минимальные значенияинтенсивностей ультразвукового расщепления (то есть точки, соответствующиеграницамраспределенияполоспоинтенсивностям)неучитывалисьпристатистическом анализе. Общее число таких выброшенных значений составило около4% от полного числа точек. Группа максимальных значений, отброшенная при анализе,является следствием дефектов на геле или присутствием чужеродных фрагментов(пример такого дефекта виден в левом нижнем углу Рис.2.2).

Вторая группа, - группа сминимальными значениями интенсивности расщепления является следствем невернойапроксимациисуммарнойинтенсивностиполосыиз-заееискривленияилиперекрывания с соседней полосой (такие перекрывания также можно увидеть в верхнейчасти дорожек на Рис.2.2).Общее число проанализированных полос составило около 20500. Для анализазависимости относительной частоты разрыва фосфодиэфирной связи от локальнойнуклеотиднойпоследовательностииспользовалисьди-итетрануклеотидноеприближения. Для исследования влияния типа ди- и тетрануклеотида, в которомпроисходитрасщепление,навеличинуотносительнойчастотырасщепленияприменялся однофакторный дисперсионный анализ, непараметрические критерии(Kruskal-Wallis test, Brown-Mood test).

Результаты анализа позволяют сделать вывод отом, что влияние типа динуклеотида на относительную частоту его ультразвуковогорасщепления статистически значимо на уровне p<<α=0.05. В Таблице 1 и на Рис.2.4приведены значения выборочных характеристик и 95% доверительные интервалы длясредних значений относительных частот расщепления.Как видно из Таблицы 1 и Рисунка 2.4, значения средних относительных частотультразвукового расщепления комплементарных динуклеотидов различаются значимо.Это указывают на независимость расщепления комплементарных цепей.34Таблица1.Значениявыборочныххарактеристикультразвукового расщепления динуклеотидов.Обозначения:N – объѐм выборки;R – средняя величина;S – стандартное отклонение;NRSAA16360.9190.129AC10760.9130.128AG10280.9000.124AT13740.9040.119CA12651.1600.209CC11411.0070.144CG12301.4440.334CT10771.1300.198GA11530.9700.133GC13170.9540.146GG11680.9220.145GT11010.9520.126TA10650.9730.120TC11730.9120.131TG13050.9790.126TT16720.9320.12735относительныхчастотДля того, чтобы выяснить для каких динуклеотидов их интенсивностиультразвукового расщепления значимо не равны, и для какого динуклеотидаотносительную частоту расщепления можно считать максимальной (минимальной),использовались параметрические (Tukey-Kramer, GT2-, T'-) и непараметрический(Kruskal-Wallis test) методы множественного сравнения.

Результаты проведенногомножественного сравнения показывают, что средние значения ультразвуковогорасщепления в динуклеотидах CC, CT, CA, CG статистически значимо отличаются другот друга и от средних значений для всех других динуклеотидов. Выборочное среднеедля CG является максимальным значением относительной частоты ультразвуковогорасщепления динуклеотидов.Исследование влияния типа динуклеотида во втором положении (3‟-концевого)на относительную частоту ультразвукового расщепления в каждой из четырех группдинуклеотидов, различающихся по первому (5‟-концевому) нуклеотиду, позволяетсделать вывод, что в каждой из четырех групп такое влияние значимо на уровнеp<<α=0.05.

Применение методов множественного сравнения для каждой из четырехгрупп динуклеотидов дает следующие результаты:a) в группе динуклеотидов AN (AA, AC, AG, AT) нельзя выделить динуклеотид,среднее значение ультразвукового расщепления которого значимо больше или меньше,чем у всех других;b) в группе динуклеотидов CN (CA, CC, CG, CT) все средние значенияразличаются значимо, причем среднее в группе СС минимально, а среднее в CG –максимально;с) в группе динуклеотидов GN (GA, GC, GG, GT) среднее в GG минимально, асреднее в GA – максимально;d) в группе динуклеотидов TN (TA, TC, TG, TT) среднее в TC минимально.Необходимоотметить,чторезультаты,полученныеприпомощипараметрических методов анализа, подтверждаются и непараметрическими методами.36Рис.2.4.