Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком, страница 13

Данная структура приведена в качествеиллюстрации, так как отражает некоторые особенности изменения структурныхпараметров вдоль ДНК, хорошо известные как из данных кристаллографии и ЯМР, таки молекулярно-динамических расчетов.77Рис. 5.3. Фрагмент структуры ДНК, построенной для последовательности λ-фага врамках параметризации структурных параметров, полученных при помощи данныхЯМР. Приведенная структура демонстрирует изменение угла между локальной осьюдвойной спирали (направление которой можно считать перпендикулярным кплоскости, образованной парами оснований) и глобальной осью ДНК.Ниже для одной из цепей полученной структуры приведен график зависимостиугла α между направлением фосфодиэфирной связи C3‟-O3‟ и главной осью двойнойспирали ДНК от номера данной связи вдоль цепи.Рис.5.4. Зависимость угла α между направлением фосфодиэфирной связи С3’-O3’ иосью спирали от номера связи вдоль данной цепи сахарофосфатного остова.Как видно из графика, данный угол изменяется с периодичностью в 10нуклеотидов, что и следовало ожидать от структуры свободной ДНК.При растяжении молекулы угол между фосфодиэфирной связью и силойрастяжения влияет на степень деформации связи и, следовательно, вероятность еѐ78разрыва.

Поэтому, выявленная при анализе картины ультразвукового расщепленияДНК λ-фага периодичность величиной около 20 нуклеотидов может быть связана сизменением общей периодичности структуры ДНК – так как известно, что при наличиирастягивающего усилия ДНК может частично расплетаться [Gore et al, 2006]. В такомслучае период в 20 нуклеотидов может быть связан с изменением параметров двойнойспирали ДНК при действии растягивающего усилия.5.2. Применение данных по специфичности ультразвукового расщепления ДНКдля анализа промоторных областей генома человека.Как уже отмечалось в Главе 1, в настоящее время для решения задачилокализации функциональных областей в геномах все чаще используются данные оконтекстной зависимости различных физико-химических свойств ДНК. Данный разделпосвящен исследованию возможности применения данных по специфичностирасщепления ДНК ультразвуком для выявления особенностей промоторных областейгенома человека, которые затем могут быть использованы в качестве дополнительногокритерия при поиске функциональных сайтов в геноме человека.Вданномразделедлятеоретическогоанализапромоторныхпоследовательностей генома человека используются приведенные в Главе 2 данные оспецифичностиультразвуковогорасщепленияДНК.Полученныевеличиныотносительных частот расщепления, как было показано в Главе 4, по всей видимости,отражают локальную конформационную подвижность сахарофосфатного остова ДНК:чембольшеотносительнаячастотаультразвуковогорасщепленияданнойфосфодиэфирной связи, тем более подвижным является сахарофосфатный остов всоответствующем участке молекулы.Следуетотметить,ультразвуковогочторасщепленияполученныепозволяютвеличиныразличатьотносительныхособенностичастотструктурнойдинамики сахарофосфатного остова в каждой из цепей ДНК: в Главе 2 было показано,что величины относительной частоты расщепления фосфодиэфирных связей вкомплементарных динуклеотидах могут значимо различаться (см.

Раздел 2.3 Главы 2).79Поэтому, при исследовании геномных последовательностей появляется возможностьанализировать конформационно-динамические особенности обеих цепей двойнойспирали ДНК.Используя значения, приведенные в таблице 2 Главы 2, были рассчитаны профилиультразвукового расщепления для последовательностей 648 промоторов геномачеловека (MYC кластер, взятый из базы данных Transcriptional Regulatory ElementDatabase: http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home).Все последовательности изначально были выровнены: рассматривался блок длинойв 1000 нуклеотидов, содержащий 700 нуклеотидов до точки старта транскрипции и 300– после.Для каждой последовательности строился теоретический профиль ультразвуковогорасщепления на основании данных по относительным частотам расщеплениятетрануклеотидов (Таблица 2 Главы 2), после чего полученные профили сглаживалисьметодом линейной фильтрации с окном в пять нуклеотидов.

Для построения профилейиспользовались обе цепи: вычислялась суммарная относительная частота расщепленияпо обеим цепям ДНК.На Рис. 5.5 приведен профиль ультразвукового расщепления, полученныйусреднением 648 профилей.80Рис. 5.5. Зависимость относительной частоты ультразвукового расщепления ( R )от позиции соответствующей фософодиэфирной связи (n) по отношению к точкеначала транскрипции (0). Приведен средний для 648 последовательностей профильультразвукового расщепления.Из Рис.5.5 видно, что рассматриваемая характеристика имеет явную аномалию врайоне старта транскрипции.

Полученный профиль соответствует обнаруженным ранеерезультатам - возрастанием к месту сайта старта транскрипции частоты встречаемостицитозинов и гуанинов в последовательности [Abeel et al, 2008; Cao et al, 2008]) иявляется следствием увеличения относительной частоты ультразвукового расщепленияфосфодиэфирных связей, следующих за дезоксицитидином.Для того, чтобы нивелировать вклад этого фактора, была использована величина,которая характеризует влияние фланкирующих (то есть ближайших по цепи)нуклеотидов на ультразвуковое расщепление фосфодиэфирной связи в данномдинуклеотиде:S ( n) R (N n-1 N n*N n 1 N n  2 )  R (N n*N n 1 )R (N n-1 N n*N n 1 N n  2 )81(5.2),где R (Nn-1Nn*Nn+1Nn+2) – средняя относительная частота расщепления центральнойфосфодиэфирной связи тетрануклеотида Nn-1NnNn+1Nn+2 , а R (Nn*Nn+1) - средняяотносительная частота расщепления динуклеотида NnNn+1.

Звездочка обозначаетусловное положение разрыва.При S(n)<0 фланкирующие нуклеотиды приводят к уменьшению ультразвуковогорасщепления по сравнению со средним для данного динуклеотида значением и,следовательно, к уменьшению локальной подвижности сахарофосфатного остова, а приS(n)>0 – наоборот, - к увеличению ультразвукового расщепления по сравнению сосредним значением для данного динуклеотида, а значит, к увеличению локальнойподвижности остоваНа Рис.5.6 представлен усреднѐнный профиль, полученный аналогично первомурисунку, но для величины S(n), соответствующей кодирующей нити.Рис.5.6.Зависимостьрасщепления(S)приотносительногопереходеотизменениячастотыдинуклеотидногокультразвуковоготетрануклеотидномуприближению от положения соответствующей фосфодиэфирной связи (n) поотношению к точке начала транскрипции (0).

Приведен средний для 648последовательностей профиль величины S(n).82Из Рис. 5.6 видно, что область до сайта старта транскрипции в среднемхарактеризуется величинами S(n) <0, причем переход к более высоким значениям S(n)достигается на сравнительно небольшом участке – в области от -150 до 1 нуклеотида,после чего величины S(n) принимают значения, близкие к нулевому.Полученный результат позволяет предположить, что в промоторных участкахДНК человека нуклеотиды эволюционно отобраны таким образом, что имеет местотенденция к уменьшению подвижности сахарофосфатного остова. Уменьшениеконформационной подвижности промоторных участков ДНК может иметь своей цельюувеличениедоступностирегуляторныхсайтовдляфакторов,регулирующихэкспрессию генов, так как по мере уменьшения подвижности сахарофосфатного остоваДНК, как известно, происходит уменьшение вероятности образования комплексов ДНКс гистонами [Pedersen et al, 1998].Уменьшение гибкости и стабильности ДНК в промоторных участках былонеоднократно подчеркнуто различными авторами и используется в пакетах программпо предсказанию сайтов старта транскрипции в геномных последовательностях[Florquin et al, 2005; Abeel et al, 2008; Dineen et al, 2009; Cao et al, 2008].

Как ужеотмечалось, ключевым звеном многих алгоритмов является построение профилейразличных физико-химических характеристик ДНК. Как правило, такие алгоритмыиспользуют параметризацию, полученную в рамках динуклеотидного приближения.Проведенныйанализсвидетельствуетоналичии«эффектовпоследовательности» в промоторных участках генома человека, проявляющихся науровне тетрануклеотидного приближения, а также о возможности выявления этихэффектов при помощи полученных данных по расщеплению фрагментов ДНКультразвуком.83Основные результаты и выводы1.Получены средние относительные частоты ультразвукового расщепления ДНК,описывающие зависимость вероятности расщепления сахарофосфатного остова отпоследовательностинуклеотидныхпарврамкахди-итетрануклеотидногоприближений.2.