Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносовафизический факультетНа правах рукописиНечипуренко Дмитрий ЮрьевичАнализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком03.01.02 - БиофизикаДиссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наукНаучный руководительдоктор физ.-мат. наук, профессорТвердислов Всеволод АлександровичМосква - 20101ОглавлениеВведение....................................................................................................................................3Глава 1. Литературный обзор..................................................................................................81.1 Подходы к изучению контекстно-зависимых физико-химическихсвойств ДНК...........................................................................................................

81.2 Физика упругих растяжений ДНК......................................................................171.3 Расщепление полимеров под действием ультразвука.......................................23Глава 2. Ультразвуковое расщепление ДНК: обработка и анализ экспериментальныхданных......................................................................................................................................272.1 Описание эксперимента и процедуры обработки экспериментальныхданных..........................................................................................................................272.2 Характерные свойства ультразвукового расщепления ДНК............................302.3 Статистический анализ специфичности расщепления ДНКультразвуком...............................................................................................................34Глава 3.

Моделирование расщепления фрагментов ДНК под действием акустическойкавитации.................................................................................................................................453.1 Моделирование динамики кавитационного пузырька......................................453.2 Моделирование взаимодействия фрагмента ДНК с кавитационнымтечением.......................................................................................................................513.3 Моделирование кинетики расщепления фрагментов ДНКпод действием акустической кавитации...................................................................553.4 Обсуждение...........................................................................................................61Глава 4.

Подходы к интерпретации специфичности расщепления ДНКультразвуком...........................................................................................................................644.1 Особенности конформационной динамики B- формы ДНК............................644.2 Влияние конформационной подвижности дезоксирибозы на эффективностьультразвукового расщепления ДНК.........................................................................674.3 Обсуждение...........................................................................................................72Глава 5.

Исследование особенностей ультразвукового расщепления функциональныхобластей ДНК..........................................................................................................................755.1. Особенности ультразвукового расщепления ДНК λ-фага...............................755.2 Применение данных по специфичности ультразвуковогорасщепления ДНК для анализа промоторных областей генома человека............79Основные результаты и выводы............................................................................................84Литература...............................................................................................................................85Публикации по теме диссертации.........................................................................................89Благодарности.........................................................................................................................902ВведениеАктуальность проблемыВ процессах функционирования ДНК в живой клетке существенную роль играютвзаимодействия ДНК с белковыми комплексами и другими лигандами.

Этивзаимодействия, как правило, реализуются по принципу «узнавания» молекулами лигандами определенных сайтов молекулы ДНК.СредимножествавидовДНК-белковогоузнаваниявыделяютдвапринципиально различных типа – это так называемое «прямое» и «непрямое»узнавание.Вслучае«прямого»узнаваниябелокраспознаетопределеннуюпоследовательность пар оснований ДНК, образуя с их функциональными группамисеть контактов, присущую только данной последовательности нуклеотидов исоответствующую геометрии белковой молекулы.

В случае же «непрямого» узнаванияизбирательность связывания белковой молекулы с ДНК определяется локальными изависящими от нуклеотидной последовательности конформационно-динамическимихарактеристиками ДНК – такими как гибкость, термодинамическая стабильностьдвойной спирали, еѐ геометрия, подвижность определенных молекулярных групп и т.п.Таким образом, зависимость локальных конформационно-динамических свойств отпоследовательностипароснованийвДНКиграетважнейшуюрольприфункционировании молекулы ДНК в клетке. Поэтому, изучение контекстно-зависимыхконформационных и динамических свойств молекулы ДНК является одной изважнейших задач молекулярной биофизики.Существует ряд экспериментальных подходов к изучению структурных свойствмолекулы ДНК.

Для исследования влияния последовательности нуклеотидов наконформацию ДНК применяются методы рентгеноструктурного анализа, ЯМР, и ИК спектроскопии. Экспериментальные данные о гибкости молекулы ДНК получают припомощи анализа еѐ подвижности в геле и исследуя расщепление ДНК неспецифичнымиэндонуклеазами, а изменения геометрии малой бороздки двойной спирали вдоль ДНКизучают методами химического расщепления молекулы гидроксильными радикалами идругими химическими агентами.3При помощи перечисленных экспериментальных методик достаточно сложноизвлечь информацию о динамических характеристиках изучаемых фрагментов ДНК.Здесь на помощь приходят методы молекулярного моделирования: молекулярнаядинамика, метод Монте-Карло, а также квантово-химические расчеты.В Институте молекулярной биологии РАН в настоящее время развивается новыйэкспериментальный метод, позволяющий изучать конформационно-динамическиесвойства двойной спирали ДНК.

Метод основан на анализе картин расщепленияфрагментов ДНК под действием ультразвука высокой интенсивности. Контекстнаяспецифичностьрасщепления,тоестьзависимостьпрофилейультразвуковогорасщепления фрагментов ДНК от их нуклеотидной последовательности, позволяетизучать влияние последовательности пар оснований в ДНК на ее структурные свойствав масштабах от нескольких десятков до сотен нуклеотидов.Явление контекстной специфичности разрывов ДНК под действием ультразвукапредставляетнесомненныйнаучныйинтерескакдополнительныйисточникинформации о контекстно-зависимых характеристиках ДНК. Тем не менее, физикаэтого явления практически не изучена, что вызывает серьезные трудности при попыткеинтерпретации полученных результатов.Анализ и моделирование расщепления ДНК ультразвуком, которым посвященаданная работа, необходимы для более глубокого исследования физики этого процесса сцелью дальнейшего применения и развития основанного на этом явлении методеизучения конформационно-динамических свойств ДНК.Цели и задачи диссертационной работыЦелью данного исследования являлось выявление основных закономерностей процессарасщепления ДНК под действием ультразвука, разработка физических моделей,адекватно описывающих характерные особенности этого явления и применениеполученных данных по расщеплению ДНК для анализа функциональных участков ДНКчеловека.

Для достижения этих целей решались следующие основные задачи:- установить характерные особенности расщепления ДНК ультразвуком;- провести анализ контекстной специфичности расщепления;- разработать модель, описывающую процесс расщепления фрагментов ДНК;- сравнить полученные теоретические результаты с экспериментальными;4- разработать модель, качественно описывающую явление контекстной специфичностирасщепления ДНК ультразвуком.- исследовать особенности теоретических профилей ультразвукового расщепления,построенных для промоторных последовательностей ДНК человека.На защиту выносятся следующие положения и результаты:- получены относительные частоты ультразвукового расщепления фрагментов ДНК вди- и тетрануклеотидном приближении;- выявлено увеличение степени ультразвукового расщепления фосфодиэфирной связи,следующей за дезоксицитидином (в направлении от 5‟ к 3‟ концу фрагмента ДНК);- предложен подход к моделированию процесса расщепления ДНК под действиемкавитационных эффектов, который позволяет описать характерные особенностинаблюдаемого расщепления;- разработана модель, позволяющая качественно описать явление контекстнойспецифичности ультразвукового расщепления;- продемонстрирована возможность применения полученных относительных частотультразвукового расщепления для анализа промоторных участков ДНК человека.Апробация результатов диссертационной работыПо материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 5 статей врецензируемых научных журналах ВАК России:«Биофизика», «Журнал Структурной Химии», «Journal of Biomolecular Structure &Dynamics», «In collection: NATO Science for Peace and Security Series B: Physics andBiophysics, Nanomaterials for Application in Medicine and Biology», «BiophysicalJournal».Основные результаты исследований, представленные в диссертационной работе,докладывались на следующих международных и российских конференциях:13-ой международной конференции «Математика, компьютер, образование.