Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком, страница 12

ОбсуждениеОтправным пунктом предложенной модели является предположение о влиянииугла между осью спирали и направлением ковалентной связи, подверженной разрыву,на вероятность расщепления ДНК. Важно отметить, что данная гипотеза позволяетописатьспецифичностьрасщепления без дополнительных предположенийобособенностях конформационной динамики дезоксирибозы. Угол между направлениемфосфодиэфирной связи и вектором растягивающего усилия является динамическойпеременной, зависящей не только от состояния сахарного цикла, но и от другихособенностей локальной конформационной динамики молекулы, определяемыхпоследовательностью нуклеотидов. Важно отметить, что S↔N интерконверсиядезоксирибозы, по всей видимости, также имеет место и в дезокситимидине: в работе[Wu et al, 2003] доля N-конформациий для первой дезоксирибозы в d(TpT)динуклеотиде cоставила более 20%, в то время как значение средней относительнойчастотыультразвуковогорасщеплениядляданногодинуклеотидасоставляетнебольшую величину - 0.932.

По всей видимости, существенным является не толькосостояние дезоксирибозы, но и подвижность сахарофосфатного остова в целом. Этопредположение подкрепляетсятем,чторассматриваяотносительныечастотыультразвукового расщепления в динуклеотидах типа d(CpN) и d(TpN) (см. Рис.2.4)можно увидеть хорошо известнуюконформационнуюподвижностьзакономерность, связывающую локальнуюДНКстипомпурин-пиримидиновойпоследовательности: если в направлении от 5‟ к 3‟ концу цепи вслед за пиримидином (C или T ) следует пурин (А или G ), то конформационная подвижность будет выше, чемесли за пиримидином следовал бы пиримидин.

В общем случае эта закономерность, какбыло отмечено в Главе 1, записывается следующим образом:D (PyPu) > D (PuPu) > D (PuPy),где под D понимается общая подвижность динуклеотидного блока - величина,пропорциональная объему конформационного пространства, Py – пиримидин, а Pu –пурин. Последовательность PyPu отвечает динуклеотидному блоку ДНК, в котором внаправлении от 5‟ к 3‟ концу цепи за пиримидином следует пурин.

Если72просуммировать величины относительных частот ультразвукового расщепления R ,приведенные в Таблице 1 Главы 2, рассчитывая для каждого динуклеотидного блокасуммуотносительныхчастотрасщеплениякомплементарныхдинуклеотидов,входящих в блок, то можно получить следующий результат:R ( PyPu)= 2.32;R (PuPu)= 1.92;R (PuPy)= 1.86 ,согласующийся с рядом D (PyPu) > D (PuPu) > D (PuPy).Полученные величины относительных частот ультразвукового расщепленияДНК для 256 тетрануклеотидов также позволяют провести их сравнение с некоторымиэкспериментальными данными, полученными при помощи ЯМР спектроскопии имолекулярнойдинамики.Например,былопоказано,чтоконформационнаяподвижность центрального блока d(CpG) выше в контексте тетрануклеотидаd(TpCpGpA), чем в d(ApCpGpT) [Lefebvre et al, 1995].

Величины относительных частотультразвуковогорасщепленияцентральнойфосфодиэфирнойсвязивэтихтетрануклеотидах составляют 1.543 и 1.381, соответственно (см. Таблицу 2 в Главе 2).Какизвестно,зависимостьлокальныхособенностейконформационнойдинамики ДНК от нуклеотидной последовательности может выходить за рамкитетрануклеотидного уровня описания. В качестве примера можно рассмотретьподвижность центрального d(CpG) динуклеотидного блока в гексануклеотидахd(GpApCpGpTpC) и d(ApApCpGpTpT), которая по данным ЯМР-спектроскопиисовместно с молекулярно-динамическими расчетами в первом гексануклеотидезначительно выше, чем во втором [Cordier et al, 1999]. В проанализированной выборкепо ультразвуковому расщеплению, данные гексануклеотиды встречаются 11 и 9 раз,соответственно,асредниевеличиныотносительнойчастотырасщепленияцентрального динуклеотида d(CpG) для данных контекстов составляют 1.61 и 1.32соответственно, что также качественно согласуется с экспериментальными данными.73Таким образом, специфичность ультразвукового расщепления может отражатьне только особенности конформационной динамики дезоксирибозы, но и общуюподвижность сахарофосфатного остова ДНК, так как и то, и другое можетсущественным образом влиять на распределение растягивающей нагрузки по степенямсвободы молекулы.

Следует отметить, что с точки зрения основной гипотезы,обозначенной в начале данного раздела, также не важен механизм разрыва ковалентнойсвязи (это может быть не только гидролиз, но и прямая диссоциация связи), и ее тип –то есть это может быть как С3‟-O3‟, так и O3‟-P связь.Следует подчеркнуть, что в случае реакции гидролиза существенным фактором,определяющим скорость реакции, является доступность фосфодиэфирной связи длямолекулрастворителя.Величинадоступнойдлярастворителяэффективнойповерхности фосфодиэфирной группы атомов влияет на энтропийный множитель ввыражении для скорости химической реакции (3.5) и может зависеть от локальныхконформационно-динамических свойств сахарофосфатного остова.

Таким образом, приописании наблюдаемой специфичности расщепления важную роль также может игратьвклад энтропийного фактора гидролиза фосфодиэфирной связи.74Глава 5. Исследование особенностей ультразвукового расщепленияфункциональных областей ДНКВ данной главе рассмотрены экспериментальные данные ультразвуковогорасщепления регуляторных областей ДНК λ-фага, а также проведено исследованиепрофилей ультразвукового расщепления, построенных для промоторов MYC–кластерагеномачеловекаспомощьюстатистическихданныхпоспецифичностиультразвукового расщепления ДНК.5.1 Особенности ультразвукового расщепления ДНК λ-фага.Как было показано в предыдущей главе, данные по ультразвуковомурасщеплениюДНК,повсейконформационно-динамическихвидимости,свойствотражаютзависимостьсахарофосфатногоостовалокальныхДНКотпоследовательности нуклеотидов, причем в некоторых случаях эта зависимость неможет быть описана на уровне тетрануклеотидного приближения.

Ниже приведенпрофильультразвуковогорасщепленияфрагментаДНК,содержащегоблокрегуляторной последовательности ДНК λ-фага.Рис.5.1. Нормализованный профиль ультразвукового расщепления фрагмента ДНК,содержащегорегуляторныйучастокпоследовательностиДНКλ-фага.Триоператорных участка – OR1, OR2 и OR3, с которыми связываются белки –регуляторы транскрипции, отмечены серым цветом.75Наблюдаемаяпериодичностьприведенногопрофиляультразвуковогорасщепления, составляющая величину около 20 нуклеотидов, не может быть описана врамках тетрануклеотидного приближения.

Ниже приведен график, характеризующийотношение экспериментальных степеней расщепления (приведенных на Рис.5.1) ксредним значениям относительных частот ультразвукового расщепления, полученнымв рамках тетрануклеотидного уровня описания и приведенным в Таблице 2 Главы 2.Экспериментальное значение относительной частоты расщепления ДНК (массив этихзначенийпредставленнаРис.5.1)делилосьнаотносительнуювеличинуультразвукового расщепления соответствующего тетрануклеотида:Rотн (i ) Rexp (i)RN i1 N i N i1 N i2(5.1),где Rexp (i) – экспериментальная величина относительной частоты расщепления,RNi1Ni Ni1Ni2 - средняя относительная частота ультразвукового расщепления центральнойфосфодиэфирной связи тетрануклеотида N i 1 N i N i 1 N i  2 . После вычисления массивазначений по формуле (5.1), соответсвующий профиль был сглажен методом линейнойфильтрации с окном в пять нуклеотидов. На Рис.5.2.

представлены результаты расчета.Рис. 5.2. Профиль, характеризующий отношение экспериментальной относительнойчастоты расщепления Rexp к ожидаемому значению относительной частотыультразвукового расщепления RNi1Ni Ni1Ni2 , полученному в рамках тетрануклеотидногоприближения, в зависимости от номера фосфодиэфирной связи i. Приведеннаянумерация соответствует порядку следования полос на Рис. 5.1.76Как видно из Рис.5.2, наличие периодичности в экспериментальном профилерасщепления не может быть описано при помощи статистических данных порасщеплению, полученных в рамках тетрануклеотидного приближения.Можно предположить, что наблюдаемый профиль ультразвукового расщепленияотражает некую структурную особенность операторного блока.

В таком случаеобнаруженная периодичность степени ультразвукового расщепления около 20нуклеотидов может отражать специфику изменения определенных конформационнодинамических свойств вдоль данного участка ДНК. Стоит отметить, что даннаяпериодичность не соответствует особенности расположения операторных участков:Операторный участок ОR2 расположен на «расстоянии» в 22 нуклеотида от участкаОR1, а ОR3 – на «расстоянии» 23 нуклеотидов от OR2. Это хорошо видно из рисунка5.1. – в котором первый минимум расщепления приходится на среднюю часть OR1, апоследний – на начало OR3.Альтернативное объяснение выявленной периодичности относительных частотультразвукового расщепления связано с особенностями процесса расщепления ДНК.Согласно предложенной в Главе 4 гипотезе, основным фактором, влияющим навероятность расщепления фосфодиэфирной связи, является ее ориентация поотношению к растягивающему усилию.

Важно отметить, что для свободной ДНК врастворе угол между фосфодиэфирной связью и локальной осью двойной спиралиявляется динамической переменной, а направление локальной оси ДНК может несовпадать с направлением глобальной оси двойной спирали, определяемой в масштабахдесятков нуклеотидных пар. В качестве иллюстрации к сказанному выше далееприведена структура фрагмента ДНК λ - фага, построенная на основе известныхконтекстно-зависимых конформационных параметров ДНК, полученных при помощианализаданныхЯМР(сервиспредставленнасайтеhttp://hydra.icgeb.trieste.it/dna/model_it.html).