Автореферат (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования)

На правах рукописиТолстова Анна ПавловнаАНАЛИЗ ДАННЫХ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ СПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯСпециальность 03.01.02 – «Биофизика»,АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква – 20151Работа выполнена в МГУ им М.В. Ломоносова, Физический факультет,Кафедра биофизикиНаучные руководители:Официальные оппоненты:Ведущая организация :Твердислов Всеволод Александрович, докторфизико-математических наук, профессор.Дубровин Евгений Владимирович, кандидатфизико-математических наук.Мазо Михаил Абрамович, кандидат физикоматематических наук, старший научныйсотрудник, руководитель группы Институтахимической физики им.

Н.Н.Семенова РАН,Быстров Владимир Сергеевич, докторфизико-математических наук, ведущийнаучный сотрудник, руководитель Группыкомпьютерного моделирования молекулярныхнаноструктур и биосистем ОПИТ Институтаматематических проблем биологии РАНИнститут Биохимической физики им. Н.М.Эмануэля Российской академии наукЗащита состоится 17 декабря 2015 года в 17-00 на заседаниидиссертационного совета Д 501.002.11 при Московском государственномуниверситете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва,Ленинские горы, д.1, стр. 2, физический факультет МГУ, ЦФАС диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московскогогосударственного университета имени М.В.Ломоносова и на сайтедиссертационного совета http://www.phys.msu.ru/rus/research/disser/sovetD501-002-11/Автореферат разослан _________________________________________(дата)Ученый секретарьдиссертационного советакандидат технических наукСидорова Алла Эдуардовна2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работы.

В настоящее время трехмерная структура белков ибелковых комплексов является объектом изучения сразу несколькихобластейнауки,отструктурнойбиологиидобиоинженерииибиоинформатики. В связи с ростом производительности компьютеров сталовозможным производить весьма сложные и ресурсоемкие компьютерныеэксперименты по изучению трехмерной структуры белков с атомистическимразрешением. Компьютерное моделирование, а именно молекулярнаядинамика, метод Монте-Карло и докинг, сдвинули фокус в изучениибелковых структур и их конформационных изменений от экспериментов ктеории.Однако, далеко не все известные науке белки могут участвовать в моделях.Исходными данными для компьютерных экспериментов служат данныевысокогоразрешенияреальныхэкспериментов,аименнорентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).Появление каждой структуры в компьютерных банках данных структурбелков - трудоемкий и долгий процесс.

При этом, большие белки неисследуются методом ЯМР, а РСА позволяет получить структуру толькомалоподвижныхчастей белков, оставляя на месте подвижных частейпробелы. Следует также отметить, что методы секвенирования последнихлет позволяют накапливать данные об аминокислотной последовательностибелковcэкспоненциальнорастущейскоростью.Наблюдаетсявсевозрастающий разрыв между количеством известных последовательностей иколичеством известных структур.

Для устранения этой проблемы возниклацелая наука по предсказанию структур белков по их аминокислотнойпоследовательности. На данный момент стало возможным предсказатьструктуруотдельныхнебольшихпропусковваминокислотнойпоследовательности трехмерных структур белков, полученных методом РСА.Тем не менее, существуют работы, доказывающие, что предсказанные3структуры близки скорее к своим прототипам, т.е. как правило кгомологичнымбелкам,чемкбелку-цели,апоэтомутребуютэкспериментальной верификации. Все вместе это характеризует некоторуюпроблемувобластиструктурнойбиологии:появилисьновыемногообещающие и быстрые методы компьютерного моделирования,которые,темнеменее,оказываютсянапрямуюзависимыотэкспериментальных данных.Наиболее адекватным экспериментальным методом, позволяющим изучатьконформационные особенности отдельных крупных белков и белковыхкомплексов in vitro и в режиме реального времени является атомно-силоваямикроскопия(АСМ).Вкачестведостоинствследуетупомянутьотносительную простоту и дешевизну метода, а в качестве недостатка низкое разрешение и необходимость адсорбции на поверхность объектовизучения.

В последние годы ряд работ по модификации поверхностей дляАСМ позволил существенно увеличить возможности метода. Становитсявозможным различать отдельные домены в структуре единичной белковоймолекулы, узнавать их характерные размеры. Исследовать структуру,свойства особенности и процесс формирования белковых комплексов.Цель данной работы - выяснить физические особенности взаимодействиякласса белков, имеющих неструктурированные участки, in vitro и в условияхпространственных ограничений (на подложке) с помощью атомно-силовоймикроскопии и полноатомной молекулярной динамики для развитияметодологии анализа данных (преодоление молекулярного разрешения, учётароли подложки) атомно-силовой микроскопии.Для этого были выбраны два белка, σ70-субъединица РНК-полимеразыEscherichia coli и фибриноген человека.

Оба белка обнаруживают склонностьк амилоидному фибриллообразованию в нативных условиях, которое былохорошо изучено в АСМ-исследованиях. Оба белка имеют пропуски в4трехмерной структуре: у фибриногена отсутствует информация об αС-цепях,предполагаемых участках связывания между белками внутри фибриллы. Всвязи с этим, в данной диссертации исследовался процесс адсорбции одноймолекулы фибриногена на различные по своим физическим свойствамповерхности методами АСМ и молекулярной динамики с последующимсравнением полученных результатов.У σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.coli не расшифрованы два небольшихучастка внутри белковой глобулы. В данной работе исследовалосьфибриллообразование σ70-субъединицы методами АСМ и компьютерногомоделирования с последующим сравнением результатов.Для выяснения возможной применимости результатов компьютерногомоделирования к трактовке и повышения информативности данных АСМбыло проведено моделирование адсорбции молекулы белка лизоцима изкуриного белка, и сравнение полученных результатов с данными АСМ.Лизоцим хорошо изучен и не имеет пропусков в структуре.В соответствии с вышеизложеннойцельюбыли сформулированыследующие задачи:Были поставлены следующие научные задачи:1) Анализ состояния методов молекулярной динамики и атомносиловой микроскопии в приложении к исследованию классабелков с неструктурированными участками.2) Разработка метода молекулярной динамики в приложении ксравнению данных с данными атомно-силовой микроскопии3) Исследование биологически важных конформаций класса белков,имеющихнеструктурированныеучастки,методамимолекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии1.Научная новизнаВпервые построена молекулярная модель фибриллы σ70-субъединицы РНК полимеразы E.coli.52.Впервыепостроеныσ70-субъединицымоделиРНКполимеразы E.coli с восстановленными участками структуры приразной ионной силе.3.ПостроенамодельсинтетическоймолекулыGraphiteModifier(GM).4.Впервые промоделирована адсорбция GM на поверхностьграфита.5.Впервыепостроенамодельслюды,покрытойгексаметилдисилозаном.6.Получена модель адсорбции лизоцима на поверхностьслюды.7.Предложенметодполучениятопологииповерхностиадсорбированного белка.Научная и практическая значимость работыРезультаты работы имеют как практическую, так и научную значимость.Результатыэкспериментов,связываниямолекулформирующихструктурыаименновыяснениеσ70-субъединицытипа«бусинаРНКнахарактерныхполимеразынити»,местE.сoli ,которыезатемпредположительно сворачиваются в спираль, формирующую фибриллу,представляют ценность как для ученых, занимающихся исследованиемкомплекса бактериальной РНК полимеразы и выяснением свойств и функцийотдельных белков в этом комплексе, так и для ученых, решающих общую длямногих белков проблему возникновения амилоидных фибрилл.Данные об адсорбции фибриногена на различные поверхности хорошокоррелируют с данными АСМ-исследований и дополняют их, позволяясделать вывод о характере взаимодействия с подложками αС-цепей,подтверждая таким образом одну из двух теорий, разрабатываемых наданный момент ведущими учеными в этой области.

Поскольку сами αС-цепине фигурировали в компьютерном исследовании, выполненная работа6открывает перспективы для повышения точности и адекватностиметодамолекулярной динамики.Данные об адсорбции лизоцима на поверхность слюды позволяют вперспективе перейти кавтоматическому объединению данных АСМ имолекулярной динамики и повышению информативности АСМ.Все вместе проведенные компьютерные и АСМ эксперименты представляютнаучную иметодологическую ценность, внося вклад в развитие обоихметодов и показывая перспективность объединения их результатов.1)Положения, выносимые на защитуМолекулярные модели фибриллσ70-субъединицыполимеразыE.coli,позволяющиеисследоватьранниеРНКстадииамилоидоза.2)Уточненныемолекулярныемоделиσ70-субъединицыРНКполимеразы E.coli с восстановленными участками в водной среде приразных уровнях ионной силы, позволяющие исследовать процесссамоингибирования белка при высоких концентрациях солей.3)Молекулярные модели адсорбированных белков фибриногена илизоцима на поверхности слюды и других исследуемых в АСМподложек.4)Молекулярныемоделиподложексвежесколотогографита,графита, покрытого слоем молекул GM, свежесколотой слюды ислюды, покрытой гексаметилдисилозаном, позволяющие проводитьмоделирование адсорбции белков.5)Методполучениятопологииповерхностимолекулярныхмоделей адсорбированных белков.Личный вклад диссертантаАСМ-изображения лизоцима получены и обработаны автором лично.Все модели в среде Gromacs построены автором лично.7Параметризация подложек и подбор парциальных зарядов, а такжеконструирование новых молекул и подложек проведены автором лично.Построение топологий поверхности адсорбированных белков и сравнение сданными АСМ проведено автором лично.Данные АСМ по адсорбции фибриногена на исследуемые поверхностиполучены совместно с Протопоповой Анной Дмитриевной.Данные АСМ по фибриллообразованию сигма-фактора получены совместнос Кузьминой Натальей Викторовной.Модели в среде NAMD построены совместно с Оферкиным ИгоремВладимировичем.Все результаты, составляющие основное содержание диссертации, полученыавтором самостоятельно.Апробация работы.