Автореферат (1102343), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Основные результаты диссертационнойдокладывались на следующих научных конференциях и школах:работы1. VIII Международная конференция "Проблемы биологическойфизики" 27-28 ноября 2009 Москва, Россия2. МеждународнаяконференцияЛомоносов2010,Выставкаинновационных проектов и достижений молодых ученых СНГ, 12апреля 2010, Москва, Россия3. Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики,физики и химии 26 - 30 апреля 2010 , Севастополь, Украина4. Четвертаямеждународнаяконференция"Современныедостижения бионаноскопии", 15 - 18 июня 2010, Москва, Россия5. Международная конференция Ломоносов 2011, 11 — 15 апреля2011, Москва, Россия6. Пятая международная конференция «Современные достижениябионаноскопии», 15–17 июня 2011 Москва, Россия7.
17th International Biophysics Congress, 31 октября – 3 ноября 2011Пекин, Китай88. 2-я Международная школа по физике поверхности «Технологии иизмерения атомного масштаба», 1-7 октября 2012 Сочи, Россия9. Научнаяконференцияпобиоорганическойхимииибиотехнологии "X чтения памяти академика Юрия АнатольевичаОвчинникова", 14-17 ноября 2011, Москва, Россия10.Международная конференция Ломоносов 2015, 13-17апреля 2015, Москва, Россия11.Международная конференция Super resolution in differentdimensions, 2-3 июня 2015, Москва, Россия12.Международная конференция 18th International Conference of noncontact Atomic Force Microscopy, 7-11 сентября 2015, Кассис, ФранцияПубликации. По теме диссертационой работы опубликовано 15 работ, в томчисле 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в переченьВАК, 1 статья в нерецензируемом журнале, 1 публикация в сборнике трудови 11 публикаций в сборниках тезисов докладов конференций.Структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, 3 глав,заключения и списка цитируемой литературы из 151 наименования. Работаизложена на 130 страницах машинописного текста и включает 32 рисунка и10 таблиц.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо Введении излагается актуальность выбранной темы диссертации, еенаучная новизна и практическая значимость, определяются ее цели и задачи.Первая глава диссертации представляет собой обзор литературы и состоитиз пяти разделов, содержащих описание методов молекулярной динамики иатомно-силовой микроскопии, их областей применения и возможностей.Также в конце главы имеется заключение, содержащее постановку задачидиссертационнойработы,вытекающуюсовременных работ на тему исследования.9изпроведенногоанализаВторая глава посвящена вопросам применимости метода компьютерногомоделирования белков с неструктурированными участками, полученныхметодомРСА,ксовместнойтрактовкеданных,полученныхэкспериментальными методами.
Рассматриваются проблемы, вытекающие изнесовершенств исходных структур белков для моделирования, а такженекоторые ограничения молекулярной динамики в связи с несовершенствомбаз данных структур твердых тел.Раздел 2.1 отвечает на вопрос, возможно ли вообще, имея кристаллическуюструктуру с невысоким разрешением (больше 2 Å), полученную методомРСА, уточнить ее только с помощью компьютерного моделирования.
Дляответа на этот вопрос была сделана выборка белков, у которых нетнеструктурированных участков, а также есть несколько структур в банкахданных, полученных методом РСА с разным разрешением. Для таких белковпроводилась процедура минимизации энергии. Эта процедура смещает белокпо энергетической плоскости, отражающей все возможные конформации ипромежуточные состояния белка, в энергетический минимум. Справедливопредположить, что это может быть глобальный энергетический минимум,соответствующий точной укладке белка в кристалле, когда координатыкаждого атома в модели и в реальном кристалле совпадают.
Однако, путемсравнения минимизированных, не минимизированных и сгенерированных, азатем случайно возмущенных, структур было выяснено, что минимизацияэнергии сама по себе не приводит белок в глобальный энергетическийминимум в энергетическом пространстве, а значит, идеально разрешеннаяструктура не может быть достигнута. Следовательно, любое моделирование сиспользованием данных РСА использует не тот белок, который участвует вреальных экспериментах, а несколько отличающуюся структуру, а значит,требует верификации экспериментом.В разделе 2.2. рассмотрена вторая проблема структур белков, полученныхметодом РСА, – наличие пропусков в структуре, соответствующих10подвижным областям белка.
Существующие на данный момент методыпредсказания структуры белка по его аминокислотной последовательностиприводят к большим различиям между предсказанными и существующими вреальности участками. Тем не менее, при наличии небольших пропусков,выбранный для анализа белок σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. сoliдемонстрировал тот же характер изменений структуры при измененииионной силы раствора, что и в многочисленных ЯМР-экспериментах,биохимических и генных экспериментах, подтверждая наличие активной инеактивной форм домена, отвечающего за связывание с ДНК .АГБВДРисунок 1. Результаты моделирования полной σ70-субъединицы после 150 нс при разныхконцентрациях солей: А - начальная структура после добавления недостающих участков пептиднойцепи, Б - σ70-субъединица после 150 нс моделирования с нулевой концентрацией ионов, В - в 20мМNaCl и 5 мМ MgCl2, Г - в 40 мМ NaCl, Д - в 40 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2.Цветомвыделеныдомены: 1.1(7-100АК) - зеленый, NCR (127-370) - красный, 2.3(416-434АК) - оранжевый, 2.4(435-453АК)- желтый, 4.1(536-565АК) - розовый, 4.2(566-613АК) - голубой.Для получения полной структуры белка был проведен анализ имеющихся 20структур в банке данных, после чего были выбраны наиболее близкие порезультатам выравнивания структуры с перекрывающимися областями врайоне пропусков, и отдельные области белка были перенесены из одной11структуры в другую.
Это позволило уменьшить области для предсказания,увеличив, однако, их число. Далее, неполные и полные структурыучаствовали в моделировании при разной концентрации ионов в растворе втечение 100-150 нс (Рис.1).Рисунки 1 А, Г, Д демонстрируют активную форму σ70-субъединицы, когдаконцевой домен 4 белка свободен и не взаимодействует с доменом NCR привысоких концентрациях солей, а рисунки 1 Б и В - неактивную, когдаконцевой домен 4 ингибирован областью сильного отрицательного заряда издомена NCR при низких концентрациях солей. Похожий результат былполучен и для неполной структуры σ70 субъединицы.
Однако там, из-заотсутствия связи с остальной частью белка, домен 1.1 в случае низкойконцентрации соли также приближался к домену 4. То, что полная инеполная структуры продемонстрировали одинаковый характер измерений взависимости от ионной силы, говорит о большем влиянии электростатики напроцесс фибриллообразования, чем специфических водородных связей,возникающих, по данным литературы, между 1 и 4 доменами.Полученный результат показывает успешность применения молекулярнойдинамики для трактовки экспериментальных данных. Тем не менее, такимсравнением невозможно добиться окончательного ответа на вопрос, каковаструктура неизвестных областей белка. Для этого нужен экспериментальныйметод, позволяющий распознать трехмерную структуру отдельных областейбелков.
Современная атомно-силовая микроскопия далеко шагнула в этойобласти,сприменениемспециальныхпокрытий,увеличивающихконтрастность изображения. Однако, не следует забывать, что на рельефповерхности белка, полученного в АСМ, влияет не только реальнаятопология объекта, но и электростатика, и его упругость, поэтому учет этихвзаимодействий белка с подложкой и белка с кантилевером очень важен дляинтерпретации данных АСМ.12Раздел 2.3 посвящен вопросу разработки методов моделирования адсорбциибелков на различные использующиеся в АСМ поверхности.
Решениепроблемы сводится, в основном, к получению топологий поверхностей, длячего необходимо дополнять существующие силовые поля, наилучшимобразомподходящиедлямоделированиябелков,параметрамидлямоделирования твердых тел. Для простых подложек, использующихся вАСМ, как графит или слюда, можно просто взять данные из статей исправочников, и преобразовать коэффициенты в требуемые единицыизмерения.химическойВслучаеобработкикомпозитныхподложек,поверхности,полученныхтребуетсясозданиеметодомновойпараметризации для силового поля. В случае композитных подложек,созданных методом адсорбции полимерного слоя на поверхность, требуетсямоделирование до факта получения искомой композитной поверхности. Всетри варианта получения подложек для АСМ были использованы вкомпьютерном эксперименте. Моделирование подложек из графита и слюдыдемонстрировало первый вариант простых подложек, моделирование слюды,модифицированнойгексаметилдисилозаном,демонстрироваловариантхимической обработки поверхности, а моделирование графита, покрытогоАБВРисунок 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
