Автореферат (1102343), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Сконструированные в силовом поле AMBER подложки: А - оксид кремния,моделирующий слюду, Б - оксид кремния, покрытый гексаметилдисилозаном, В - графит садсорбированными на него молекулами GM13слоем композитных молекул Graphite modifier, демонстрировало вариантполучения подложек методом адсорбции (Рис.2). Все сконструированныеподложки показали высокую степень соответствия экспериментам. Они былистабильны, имели тот же поверхностный заряд, что и в экспериментах итакой же характер взаимодействия с белками.Для исследования адсорбции фибриногена на поверхность GM быласконструирована молекула GM и проведено моделирование сорбции ее награфит. Молекула GM имеет следующую структуру: (CH2)n(NCH2CO)m-NH2(Рис.3 А)АБРисунок 3. Молекула GM (А) и адсорбированные молекулы после 10 нс моделирования в воде (Б)Для получения слоя молекул на графите было проведено моделированиесистемы из 100 молекул, воды и однослойного графита в течение 20 нс, атакже системы из 200 молекул GM, воды и однослойного графита,полученной путем добавления к первой системе еще 100 молекул через 5 нспосле начала моделирования.
Эта система моделировалась в общейсложности 15 нс. В итоге 93% молекул адсорбировались на графит. На рис. 3Б видно, что GM образует на поверхности графита структуры,напоминающие шпильки. Обнаружение шпилек, возможно, объясняетламели, из которых состоит плотный слой GM на графите. Следуетотметить, что большая величина стандартного отклонения от среднего14значения для длины шпильки обусловлена тем, что система находится наначальных стадиях адсорбции. Для более точных измерений требуетсяпривести систему в состояние равновесия, что подразумевает продолжениемоделирования.
Можно заметить, что молекулы GM в целом имеюттенденцию выстраиваться по осям симметрии графита, что такжеподтверждается АСМ-экспериментами.В Главе 3 приведены данные сравнения экспериментов молекулярнойдинамики с данными АСМ-экспериментов. Глава имеет три раздела, почислу объектов исследования.Раздел 3.1 представляет собой описание и анализ результатов исследованияфибриллообразованияσ70-субъединицыРНК-полимеразыE.сoli.Представлены сведения о свойствах, структуре и роли в бактериальной РНКполимеразеσ70-субъединицы. На рисунке 4 приводятся данные АСМ-экспериментовпоадсорбциифибриллσ70-субъединицынаграфит,полученные совместно с Кузьминой Н.В. (кафедра биофизики физическогофакультета МГУ имени М.В. Ломоносова).Рисунок 4.
АСМ-изображение червеобразных фибрилл сигма-субъединицы на графите σ70субъединицы РНКП E.coli в буфере с концентрацией солей 20 мM NaCl и 5 мM MgSO4 полученные (a)в том же буфере (б) на воздухе после высушивания образца. В средней колонке представленыувеличенные изображения червеобразных структур из областей, отмеченных на АСМ-изображениях15слева с соответствующими римскими цифрами (размер увеличенных областей 150×150 нм). Праваяколонка демонстрирует распределение высот вдоль белых линий с центральных изображений.Задачейданнойфибриллообразованияработыбылополучитьσ70-субъединицы,адекватнуюобъясняющуюмодельданныеэксперимента.Компьютерноемоделированиепроводилосьметодоммолекулярнойдинамики в среде Gromacs с силовым полем Amber99sb-ildn.
Использоваласьструктура белка 4IGC из банка данных белковых структур. Продуктивноемоделирование проводилось в течение 40 нс для димеров и 70 нс длядальнейшей полимеризации.Для получения димеров σ70-субъединицы было составлено 6 вариантоввзаимного расположения молекул, проводилось моделирование каждого изних в течение 40 нс.Рисунок 5.Димер сигма-субъединицы, полученный после 40 нс моделирования в воде сконцентрацией ионов NaCl 20мМ и MgCl2 5мМ. Красным обозначены домены NCR, голубым изеленым – концевые домены разных молекул.Димеризация возникла только в двух случаях, в первом за счетвзаимодействия концевых доменов 1.1 и 4, во втором за счет взаимодействиядоменов NCR, жестко структурированных областей 130-370 аминокислот(АК) белка. Для дальнейшего исследования был выбран вариант снаибольшим количеством контактов (Рис.
5), а именно взаимодействиедоменов NCR. Необходимо отметить, что все варианты взаимодействия16димеров друг с другом или димеров с мономерами происходили за счетвзаимодействия концевых доменов, реализуя первый вариант димеризации.Было построено четыре варианта расположения двух димеров друготносительно друга и три варианта взаимного расположения мономера идимера. В среднем, минимальное расстояние между молекулами составляло 4нм. Перед началом моделирования мономер моделировался в течение 100 нс,а димер в течение 40 нс.
Моделирование димеров с димерами и димеров смономерами длилось 70 нс.Во всех трех вариантах систем димер-мономер наблюдалось взаимодействиеконцевых доменов, в случае систем димер-димер два варианта показаливзаимодействие концевых доменов (Рис. 6), в двух других случаях никакоговзаимодействия не наблюдалось. Следует отметить, что в случае системдимер-димер наблюдалась закрученность получаемого полимера,Рисунок 6. Фибрилла σ70-субъединицы, образованная из двух димеров после 70 нс моделирования вводе с концентрацией ионов NaCl 20мМ и MgCl2 5мМпричем угол между димерами медленно увеличивался со временем, аглобулы, образованные хвостами белков, были повернуты друг относительнодруга на угол примерно в 90°, т.е.
имела место спирализация полибелковойцепи. Такая структура очень напоминает полученные в эксперименте in vitroбусины на нити в червеобразных структурах (Рис. 4). Было выдвинуто17предположение, что в дальнейшем полученная нить суперспирализуется собразованием жестких амилоидных палочек, наблюдаемых в эксперименте.Характерные размеры червеобразных структур на АСМ-изображениях былиследующие: длина 150-200 нм, размер глобул, формирующих бусины,4,2±0,6нм, а расстояние между ними от 15 до 20 нм.Также длячервеобразных структур измерялась персистентная длина, характеризующаягибкость фибриллы. Для данной концентрации ионов она составляла 22,6±1,1нм.
Один из вариантов двух взаимодействующих димеров был практическиполностью расположен в одной плоскости, поэтому оказалось возможнымоценить его персистентную длину, получившуюся равной примерно 20 нм.Расстояние между глобулами, состоящими из хвостов взаимодействующихмономеров, для обоих вариантов взаимодействия димер-димер составилооколо 13 нм и 21 нм, что хорошо согласуется с расстоянием между бусинамина нити в червеобразных структурах.Таким образом, с помощью молекулярной динамики были выясненыпредполагаемые места связывания молекул при димеризации и предложенамодель образования фибрилл σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli.Раздел 3.2 содержит описание исследования адсорбции фибриногена на18Рисунок 7.
Фибриноген на слюде (А), модифицированой HMDS слюде (Б), модифицированном GMграфите (В) и графите (Д) по данным АСМмодифицированные и немодифицированные поверхности слюды и графита.Приводятся данные АСМ-экспериментов по адсорбции фибриногена наповерхности слюды, слюды, модифицированной гексаметилдисилозаном(ГМДС), графита, и графита, модифицированного молекулами GraphiteModifier (GM). Различия в структуре белка очень велики (Рис. 7), однако,несмотря на общую тенденцию, в литературе нет единого мнения о характеревзаимодействия белка с подложками, о том, какие именно части белкаучаствуют во взаимодействии в зависимости от гидрофобности подложки.Например, существуют две гипотезы о расположении αС-цепей фибриногенана слюде: между белком и поверхностью и над белком.Компьютерноемоделированиеметодоммолекулярнойдинамикипроводилось в среде Gromacs с силовым полем Amber99sb-ildn, а также всреде NAMD с силовым полем CHARMM.
Использовалась структура белка3GHG из банка данных белковых структур.В разделе описаны результаты 5 нс моделирования адсорбции фибриногенана поверхности слюды и ГМДС в среде NAMD, силовое поле CHARMM(Рис. 8). Предварительные данные по сравнению топологий поверхностиРисунок 8. Фибриноген после 1 нс симуляции на оксиде кремния (А) и ГМДС (С), после 5 нс на оксидекремния (В) и ГМДС (D)19молекул фибриногена, полученных методами АСМ и МД, показали оченьхорошее соответствие данных АСМ и моделирования (Таблица 1).Таблица 1.Сравнение данных АСМ и МД по высоте и длине фибриногенаСлюдаГМДС-слюдаВысота (D-домен), нм Длина, нм Высота (D-домен), нм Длина, нмАСММД2,2 ± 0,442 ± 71,2 ± 0,460 ± 97,5345,541Можно заметить, что результаты моделирования и эксперимента изменяютсяв том же самом направлении при смене подложки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
