Связывающая способность и детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к атразину, страница 12

Эти реакции организованы вэлектронтранспортную цепь (ЭТЦ) - последовательность фиксированных вмембранепереносчиковэлектрона(рис. 2.5).ВЭТЦсодержитсяфотохимических центра (фотосистемы, ФС), действующих последовательно.два66В фотосистеме II (ФСII) при возбуждении РЦ происходит разделениезарядов и электрон переходит от хлорофилл а в центре Р680 (число 680обозначает, что максимум спектральных изменений системы при возбуждениисветом находится вблизи 680 нм) через промежуточный акцептор к феофитину.Далее феофитин восстанавливает первый пластохинон в ЭТЦ QA до семихинона.Семихинон (радикал Q •−A ) восстанавливает второй пластохинон QB также досемихинона.После разделения зарядов окисленный Р680 восстанавливается доначального состояния, принимая электрон от Mn-содержащего комплекса, накотором происходит реакция фотолиза воды.

Затем происходит следующий циклвозбуждения РЦ, в результате которого QB принимает второй электрон ивосстанавливаетсядопластогидрохинона.Далеепластогидрохинонотсоединяется от белка D1 и переходит в пластохиноновый-гидрохиноновыйпул, а его место занимает невосстановленный пластохинон QB. Послеследующих двух циклов возбуждения Р680 происходит полное окисление Mnсодержащего комплекса (комплекс включает в себя четыре атома Mn) иразложение двух молекул воды с образованием одной молекулы кислорода.Таким образом, в результате первичной реакции в ФСII происходит образованиедвух стабильных продуктов - пластогидрохинона и кислорода:2H2O+4hν+2PQ→2PQH2+O2(2.1)Как видно из рис.

2.5, протоны, образующиеся при разложении воды,поступают во внутреннее пространство тилакоида, в то время как протоны,необходимые для образования гидрохинона поступают из стромы. Вследствиеэтого на мембране возникает градиент протонов (во внутреннем пространстветилакоида концентрация протонов увеличивается, в строме - уменьшается).Пластохинон, образующийся в ходе реакций в ФСII, окисляетсякомплексом цитохромов b6/f, который является переносчиком электрона черезпластоцианин к фотосистеме I (ФСI). При этом протоны, высвобождающиесяпри окислении PQH2, также поступают во внутреннее пространство тилакоида,увеличивая протонный градиент. Обратный транспорт протонов из тилакоидов встрому сопровождается синтезом АТФ.

При освещении ФСI происходитокисление пластоцианина и восстановление НАДФ.67Вследствиеизбыткаэнергиивозбужденноесостояниемолекулыхлорофилла а оказывается неустойчивым. Энергия кванта быстро растрачиваетсяпо нескольким параллельным путям в результате одновременно протекающих иконкурирующих процессов.

К ним относятся: флуоресценция, растраты в тепло,тушение энергии при соударении с другими молекулами, переход в триплетноесостояние, передача энергии возбуждения (миграция) и фотохимическая реакция(Биофизика фотосинтеза, 1975). С точки зрения механизма фотосинтезасущественны только два последних процесса, которые приводят к запасаниюпоглощеннойэнергии.Однакоисследованиеконкурирующих“непроизводительных” путей оказывается черезвычайно важным источникоминформации о процессе фотосинтеза. Предполагая, что растраты в тепло,межмолекулярные взаимодействия и фотохимические реакции незначительны,считают, что растрачивание энергии идет тремя путями: флуоресценция, переходв триплетное состояние и миграция. Вероятность потери энергии возбуждения врезультатефлуоресценциифотосинтетическойзависитмембраныиототфункциональнойактивностипроцессовактивностибиосинтеза,использующих продукты световой стадии.

Поэтому на основании данных офлуоресценции хлорофилла а можно судить о структурно-функциональномсостоянии фотосинтетического аппарата клетки и, косвенным образом, офизиологическом состоянии самой клетки.Потеря энергии возбуждения происходит главным образом в результатеизлучения квантов света с энергией, соответствующей переходу хлорофилла а изпервого синглетного состояния в основное. Если такое излучение происходит дотого, как возбуждение вызовет разделение зарядов в РЦ, его называютфлуоресценцией.

Если же возбужденное состояние возникает вторично, врезультате обращения первичных фотохимических реакций, то говорят орекомбинационной, или замедленной флуоресценции хлорофилла (ЗФ) (Рубин идр., 1987). Сходство спектров возбуждения флуоресценции и ЗФ свидетельствуето том, что в обоих случаях флуоресценция испускается молекулами хлорофиллаа при переходе из их первого синглетного состояние в основное. Однаконеобходимоподчеркнуть,чтофлуоресценцияиспускаетсямолекуламихлорофилла, возбуждение которых обусловлено энергией света, тогда как ЗФобусловлена испусканием флуоресценции теми молекулами хлорофилла а,68возбуждение которых произошло в результате возвращения молекул насинглетный уровень с триплетного (по существующим данным от 1/4 до 1/2синглетно-возбужденных молекул могут переходить в триплетное состояние)(Биофизика фотосинтеза, 1975). Поэтому время жизни флуоресценции зависит отвремени жизни синглетных молекул и не превышает 10-8 секунды.

Время жизнитриплетно-возбужденныхмолекулзначительнопревышаеттаковоедлясинглетно-возбужденных, а время жизни ЗФ составляет до десятков секунд. Приэтом интенсивность ЗФ на 3-4 порядка ниже интенсивности флуоресценции(интенсивность ЗФ составляет около 1% от интенсивности флуоресценции), чтопозволяет пренебрегать интенсивностью ЗФ при регистрации флуоресценции.Флуоресценция и ее использование для диагностики состояния тестобъектов при биотестировании. В настоящее время опубликован ряд работ,использующих явление индукции флуоресценции (эффект Каутского) длядиагностикиизменениясостоянияфотосинтезирующихорганизмовподдействием сим-триазинов и других токискантов, ингибирующих процессфотосинтеза, а также для биотестирования (Brack and Frank, 1998; Salvetat et al.,1998; Trapmann et al., 1998).

Индукция флуоресценции возникает при сильномосвещениифотосинтезирующегообъектапослеегопредварительногопребывания в темноте или на слабом свету. Общий вид индукционной кривойприведен на рис. 2.6.Параметр Fo (минимальная флуоресценция) соответствует флуоресценции,когда все акцепторы (переносчики) электронов в ЭТЦ находятся в окисленномсостоянии. В условиях насыщающего освещения флуоресценция быстровозрастает и достигает своего максимального значения (Fm), когда все акцепторыв ЭТЦ восстановлены. Возрастание флуоресценции с Fo до Fm характеризуетобщее количество акцепторов, которые могут принимать электрон, то есть могутбыть восстановлены. Интенсивность флуоресценции перегиба Fi определяетсяколичеством акцептров ЭТЦ, которые могут быть восстановлены, но неспособны передавать электроны по цепи.

Отношение Fi/Fm отражает количествотаких центров от общего в долях единицы и варьирует от 0,17-0,21 воптимальных условиях до единицы у поврежденных клеток. Относительныйвыход переменной флуоресценции, характеризующий квантовую эффективностьпервичной фотосинтетической реакции, рассчитывали как Fv/Fm, где Fv=Fm-Fo. У69лабораторной культуры хлореллы в оптимальных условиях Fv/Fm обычносоставляет 0,75-0,78.

Мертвые клетки характеризуются отношением Fv/Fm,равным нулю.Fm1200Флуоресценция1000800Fi600400Fo200002004006008001000Время, мсРис. 2.6. Кривая индукции флуоресценции (эффект Каутского).Fo - минимальная флуоресценция, Fi - флуоресценция перегиба, Fm - пиковаяфлуоресценция.Привнесениивсредуингибиторовфотосинтеза,обладающихспецифическим сайтом (для атразина специфическим сайтом является QB),происходит блокирование определенных переносчиков электронов в ЭТЦ, чтоприводит к мгновенному увеличению отношения Fi/Fm, т.е.

возрастаниюколичества акцепторов, которые способны принимать электрон, но не способныего передавать по цепи. Таким образом, увеличение отношения Fi/Fm посравнению с контролем отражает концентрацию свободного токсиканта в среде.Поэтому данный показатель использовали при проведении токсикологическихэкспериментов с нулевым временем экспозиции. В отличие от Fi/Fm, снижениепоказателя Fv/Fm может происходить вследствие присутствия в среде какспецифических ингибиторов фотосинтеза, так и токсикантов с другиммеханизмом действия.Уменьшение Fv/Fm характеризуется определеннойвременной задержкой и может быть обусловлено не только изменениемсостояния ЭТЦ (как в случае с Fi/Fm), но и нарушением других важнейшихпроцессов жизнедеятельности, например, синтеза белка.

В связи с этим данный70показатель использовали при проведении токсикологических экспериментов сненулевым временем экспозиции.Регистрацию кривой индукции флуоресценции проводили при помощи 2-хлучевогоимпульсногокомпьютером.флуориметра,Возбуждениесвечениясоединенногосперсональнымосуществлялисфокусированныминтенсивным светом 50 Вт/см2 от иодно-кварцевой лампы (КГМ 24-150).Темновая пауза составляла 30 с.Замедленная флуоресценция и ее использование для диагностикисостояния тест-объектов при биотестировании.

Индукционные кривые ЗФполучают, как и в случае флуоресценции, при облучении светом растений,находившихся в темноте. Для раздельной регистрации флуоресценции и ЗФспектрыпоследейснимаютчерезопределенныйинтервалвремени,превышающий время жизни флуоресценции. Общий вид индукционной кривойЗФ представлен на рис. 2.7.YmaxФлуоресценциясетка, n%YYn0200040006000800010000Время, мсРис.

2.7. Индукционная кривая флуоресценцииКак видно из рис. 2.7, сначала происходит резкое возрастание ЗФ доначального пика интенсивности (Ymax), а затем она снижается до постояннойвеличины (Y100). Начальный подъем интенсивности ЗФ обусловлен нарушениемэлектронного транспорта вследствие временной блокировки оттока электроновот ФСII. В дальнейшем происходит активация акцепторной части ФСI иферментов углеродного цикла фотосинтеза и интенсивность ЗФ снижается.71Приустановкевозбуждающегосвета,сетки(рис. 2.7),снижениеослабляющейинтенсивностиЗФинтенсивностьпроисходитиз-зауменьшения количества возбуждаемых светом электронов. Если фотосистемапоражена и определенное количество переносчиков электронов блокировано, тоснижение, вызываемое установкой сетки, будет незначительным, т.к.

в данномслучае полное восстановление пула акцепторов электронов произойдет быстрее,а разница, возникающая при изменении интенсивности света уменьшится.Поэтому форма световой зависимости (т.е. зависимость интенсивности ЗФ отинтенсивности света) может служить характеристикой транспорта электронов вЭТЦ до и после ФСII (Васильев и др., 1988).Для диагностики изменения состояния растений под действием симтриазинов (Кафаров и др., 1985; Маторин и др., 1975; Гольдфельд и Карапетян,1989) и биотестирования (Асланиди и др., 1988) в настоящее время используюткак индукционные кривые ЗФ, так и световую зависимость ЗФ. Основнымипараметрами, используемыми для оценки состояния объектов являются: Ymax интенсивностьмаксимальнойинтенсивностимаксимальнойYmax/Y100флуоресценции;флуоресценциик-величинеотношениестационарнойфлуоресценции; τ1/2 - длительность индукционного спада и отношение Y100/Yn,где Y100 - интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света 100%, Yn интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света n% (Андреенко идр.,1985).НамибылиспользованY100/Yn,показательявляющийсяхарактеристикой транспорта электронов (Андреенко и др., 1985; Тарусов иВеселовский, 1978).Регистрацию спектров ЗФ проводили на установке, собранной на базефосфороскопа,представляющегособойсистемуизтрехкоаксиальныхцилиндров с зазором 0,5 мм между ними.