Связывающая способность и детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к атразину, страница 10

Полученный экстракт гумусовых кислот отфильтровываличерез фильтр "синяя лента" и обессоливали на катионообменнике КУ-2-8. Дляполучения более концентрированного раствора гумусовых кислот послепрохождения через катионообменник собирали лишь первые, наиболееконцентрированные порции.Выделение водорастворимого органического вещества торфов.

100 гвоздушно-сухого торфа, просеянного через сито 2-мм, заливали тремя литрамидистиллированной воды и оставляли на ночь. Затем вытяжку отфильтровываличерезфильтр"синяялента".Процедуруобработкинавескиторфадистиллированной водой повторяли дважды. Отфильтрованные вытяжкиобъединяли и обессоливали на катионообменнике КУ-2-8, предварительнопереведенном в Н-форму пропусканием 30-ти объемов 1 М HCl. Обессоленныйэкстракт концентрировали на роторном испарителе при 600°С.54Выделение всех препаратов в твердом виде (ГК и ФК почв, сумма ГК иФК торфов, сумма ГК и ФК водных экстрактов почв, водорастворимоеорганическое вещество торфов) осуществляли методом лиофильной сушки.Помимо описанных выше двенадцати препаратов гумусовых кислот,выделенных автором самостоятельно из трех образцов почв и двух образцовторфов, в работе было использовано еще 22 препарата гумусовых кислотразличного происхождения (почвы, торфа, угли и поверхностные воды), любезнопредоставленных научной группой И.В.

Перминовой (Химический факультетМГУ) и Г.У. Бальке (UFZ, Германия). Полный список исследованных препаратовгумусовых кислот и их химические характеристики приведены в табл. 3.2.2.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ2.3.1. Элементный анализC,H,N-анализ был выполнен на элементном анализаторе модели 1106фирмы Carlo Erba Strumentazione (Италия) в лаборатории микроанализаХимического факультета МГУ. Содержание кислорода рассчитывали поразности между массой беззольной навески и суммарным содержанием С, Н, N.Зольность выделенных препаратов гумусовых кислот была определена влабораториимикроанализакафедрыорганическойхимииХимическогофакультета МГУ методом сожжения в кварцевых трубках в атмосфере кислородапри температуре 750°С в течение 40 мин.Состав золы определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии сатомизацией образца в индукционно-связанной плазме (АЭС ИСП).

Определениеэлементов (Al, B, Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Si, Ti, Zn) проводили вобессоленных растворах гумусовых кислот, использованных для получениятвердых препаратов или в растворах, приготовленных путем растворениянавески гумусовых кислот в 0,1 М KOH. Результаты анализов приведены вПриложении 1.55132.3.2. Методика С ЯМР спектроскопического анализа13С ЯМР спектры гумусовых кислот регистрировали на спектрометреVXR-400. Образцы готовили растворением навески (100 мг) в 3 мл NaOD/D2O.Пропорциональность спектральных интенсивностей сигналов атомов углеродаразличных типов их реальным содержаниям в образце обеспечиваласьиспользованием времени задержки 4 с, достаточного для релаксации всех типоватомов углерода.

Влияние ядерного эффекта Оверхаузера устраняли с помощьюимпульсной последовательности INVGATE (генератор развязки от протоноввключен при считывании сигнала и выключен на период релаксационнойзадержки) (Ковалевский, 1998). Содержание углерода (С) различных типовопределяли интегрированием соответствующих спектральных областей (м. д.):220-187 - кетонных и хинонных групп (СС=О); 187-165 - карбоксильных исложноэфирных групп (ССOО-H,R); 165-145 - О-замещенных ароматическихфрагментов (СAr-O), 145-108 - незамещенных и C-замещенных ароматическихфрагментов (СAr-H,R); 108-90 - ацетальных фрагментов (СO-Alk-O); 90-48 О-замещенных алифатических фрагментов (CAlk-O); 48-5 - алифатическихфрагментов, не связанных с гетероатомами (CAlk).CС=ОCСOOH СAr-О+CCOORСAr-C,HCAlk-OCAlkCO-Alk-OРис.

2.1. Типичный 13С ЯМР спектр ГК почв с указанием использованных вработе диапазонов спектральных областей соответствующих различным типаматомов углерода.На основании полученных данных рассчитывали общее содержаниеалифатических(ΣСAlk = CO-Alk-O+CAlk-O+CAlk-H,R)иароматических56(ΣСAr = CAr-O+CAr-H,R)фрагментов.Кромеэтого.быловычисленотакжеотношение ΣСAr/ΣСAlk, характеризующее степень ароматичности гумусовыхкислот. Типичный 13С ЯМР спектр гумусовых кислот с указанием спектральныхобластей, относящихся к углероду различных типов, приведен на рис 2.1.2.3.3.

Методика гель-хроматографического определения молекулярных массАнализы по определению молекулярных масс гумусовых кислот методомгель-хроматографии выполнялись на кафедре водной химии УнивеситетаКарлсруэ (ФРГ) согласно (Perminova et al., 1998). Экспериментальные условияопределения: фракционирующий гель - TOYOPEARL-50HW(S) (Япония), размерыколонки: диаметр - 20 мм, высота - 25 см. Пробу гумусовых кислот растворяли в0,028 М фосфатном буфере (рН 6,8), который использовали в качествеподвижной фазы при проведении фракционирования.

Концентрация гумусовыхкислот во фракционируемых пробах не превышала 2 мг органического углерода(ОС)/л. Объем инжектируемой пробы - 2 мл. Скорость элюирования - 1 мл/мин.Регистрациюгумусовыхиспользованиемдвухкислотнапоследовательновыходеизколонкисоединенныхпроводилидетекторов:УФсипроточного DOC-детектора (Graentzel, Германия).Типичная гель-хроматограмма препарата гумусовых кислот приведена нарис.

2.2. На хроматограмме указаны основные параметры используемойхроматографической системы - V0 (свободный, или мертвый объем колонки) и Vt(общий объем колонки), которые составляли 26,0 и 66,8 мл, соответственно.Определение молекулярных масс проводили по калибровочному графику. Вкачестве калибровочных веществ использовали полидекстраны (молекулярнаямасса, Да: 830, 4400, 9900, 21400, 43500, 2000000), олигосахариды (342, 504),глюкозу (180), глицерин (92) и метанол (37). Калибровочный график приведен нарис.

2.3.57Интенсивность сигнала5Ve4VoVt32100102030405060708090V, млРис. 2.2. Типичная гель-хроматограмма препарата гумусовых кислот.V0= 26,0 мл (свободный объем колонки), Vt = 66,8 мл (общий объем), Ve - объемэлюирования фракционируемой пробы.Молекулярная масса, Да100 00010 0001 00010010203040506070VeРис. 2.3.КалибровочныйTOYOPEARL HW-50S.графикгель-хроматографическойколонкиОбработка полученных гель-хроматографических данных проводиласьавторомсамостоятельносиспользованиеморигинальнойкомпьютернойпрограммы GelTreat (автор - Кудрявцев А.В., Химфак МГУ).

Данная программапозволяетпроводитьпредварительнуюобработкуполучаемыхгель-хроматограмм (коррекцию базовой линии, сглаживание) и рассчитывать на ихоснове важнейшие характеристики ММР: Mn, Mw, Mz, Mw/Mz и др.582.3.4. Методика потенциометрического определения кислотных группОпределение кислотных групп в выделенных препаратах гумусовыхкислот проводили методом потенциометрического титрования в соответствии с(Georgi, 1998).

Навеску препарата массой 5 мг растворяли в 4 мл 0,1 М NaOH идобавляли 2 мл дистиллированной воды. После полного растворения пробы краствору приливали 5 мл 0,1 М HCl. Полученный раствор гумусовых кислот(рН≈2,6) титровали на автотитраторе TitroLine Alpha (Schott, Германия)раствором 0,1 М NaOH до рН 11, раствор щелочи прибавляли порциями по0,006 мл. Параллельно проводили титрование смеси 4 мл 0,1 М NaOH + 2 млдистиллированной воды + 5 мл 0,1 М HCl. По разнице кривых титрованиягумусовых кислот в смеси соляной кислоты и гидроксида натрия и кривойтитрования смеси соляной кислоты и гидроксида натрия определали кривуютитрования собственно гумусовых кислот. При расчете предполагали, чтокарбоксильные группы титруются в диапазоне рН от 3 до 7,5, а фенольныегидроксилы - от 7,5 до 10,3.

Типичная кривая титрования приведена на рис. 2.4.1210рН8642000.20.40.60.81V, млРис. 2.4. Типичная кривая титрования гумусовых кислот.1.21.4592.4.МЕТОДИКАПРИГОТОВЛЕНИЯАДСОРБЦИОННЫХКОМПЛЕКСОВ КАОЛИНИТ-ГУМУСОВЫЕ КИСЛОТЫПодготовка каолинита. Для получения адсорбционных комплексовиспользовали каолинит Kaolin CF 70 (d<2 мкм) (Caminauer Kaolinwerk GmbH,ФРГ), предварительно насыщенный натрием. Для насыщения каолинита натриемк навеске минерала массой 1 г прибавляли 20 мл 0,1 М раствора хлорида натрияс рН 5,6. Требуемое значение рН устанавливали с помощью стандартныхрастворов соляной кислоты или гидроксида натрия. Полученную суспензиювстряхивали в течение 12 часов, затем центрифугировали в течение 10 мин при3000 об/мин и производили смену раствора на свежий. Процедуру повторялитрижды.Проведение сорбции гумусовых кислот на каолините.

К полученномукак описано выше насыщенному натрием каолиниту (Na-каолинит) прибавляли20 мл раствора гумусовых кислот в 0,1 М NaCl с концентрациями от 5, 25, 50,100, 150, 200 и 250 мг/л (рН 5,6) и встряхивли 12 часов. Затем суспензиюцентрифугировали и измеряли оптическую плотность супернатанта при 240 нм.Полученные значения использовали для определения концентрации гумусовыхкислот по предварительно построенным для каждого препарата калибровочнымкривым. По разнице концентрации гумусовых кислот в растворе до и послевстряхивания с каолинитом рассчитывали количество адсорбированного накаолините углерода. Повторность трехкратная.Проведение десорбции слабосвязанных гумусовых кислот. Для удаленияслабосвязанных гумусовых кислот из состава полученных адсорбционныхкомплексов навеску комплекса 1 г, приготовленного в условиях 1 г каолинита +20 мл раствора гумусовых кислот в концентрации 200 мг/л, многократнообрабатывали 20 мл 0,1 М раствора NaCl (рН 5,6), встряхивая каждый разсуспензию в течение 12 часов.

После каждой обработки измеряли оптическуюплотность супернатанта при 240 нм и определяли содержание гумусовых кислот.Процедуру повторяли до установления постоянной концентрации гумусовыхкислот в супернатанте. Для этого, как правило, требовалось не менее восьмиобработок. Эксперимент проводили в 3-кратной повторности.60Полученные комплексы каолинита с прочносвязанными гумусовымикислотами лиофильно высушивали, отбирали навеску для анализа на содержаниеорганического углерода и использовали для проведения экспериментов повзаимодействию атразина с адсорбированными гумусовыми кислотами. Анализна содерджание органического углерода проводили методом отжига в токекислорода на приборе C-mat 5500 (Ströhlein Instruments, ГДР).