Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. БелозерскогоМГУ им. М.В. ЛомоносоваНа правах рукописиЧерняк Борис ВикторовичМЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ КЛЕТКИ ПРИ ДИСФУНКЦИИМИТОХОНДРИЙ03.00.25 – Гистология, цитология, клеточная биологияДиссертация в виде научного доклада на соискание ученой степенидоктора биологических наукМосква - 20101Научный консультант:академик РАН, профессорВладимир Петрович СкулачевОфициальные оппоненты:доктор биологических наук, профессорГалина Евгеньевна ОнищенкоБиологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносовадоктор биологических наук, профессорРената Александровна ЗвягильскаяИнститут биохимии им. А.Н.

Баха, РАНдоктор медицинских наук, профессорВсеволод Григорьевич ПинелисНаучный центр здоровья детей, РАМНВедущаяорганизация:ЗащитаИнститут канцерогенеза, Российскийонкологический научный центр, РАМНсостоитсядиссертационного советаноября162010г.назаседанииД 501. 001. 52 при Московском государственномуниверситете им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Воробьевыгоры, д.1, корп. 12, Биологический факультет МГУ, в аудитории М-1.С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться вбиблиотеке Биологического факультета Московского государственногоуниверситета им. М.В. Ломоносова.Диссертация в виде научного доклада разослана2010г.Ученый секретарь диссертационного советаКандидат биологических наукЕ. Н. Калистратова2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы.В последние десятилетиямитохондриологии.Привычное,мысталивошедшеевсвидетелямиучебникиреволюциивпредставлениеомитохондриях, как об энергетических станциях клетки, производящих АТP спомощью сложных машин, общие принципы действия которых известны(хемиосмотическая теория сопряжения), сменилось на расплывчатый образ«ящика Пандоры», в который заключены факторы, определяющие судьбу клетки.В прежней парадигме роль митохондрий в развитии патологий ограничиваласьнарушением энергообеспечения при токсических и гипоксических повреждениях ипри редких генетических нарушениях.

Теперь на передний план вышли«побочные» процессы, в которых участвуют митохондрии, такие как продукцияактивных форм кислорода (АФК), нарушение внутриклеточной передачи сигналови,наконец,выходпрограммированнуюизмитохондрийгибельвцитоплазму(апоптоз).клеткибелков,вызывающихНеканоническиефункциимитохондрий, как правило, связаны с нарушением их биоэнергетических функцийи избыточной продукцией АФК, что является серьезной угрозой для жизни клетки.Синтез АТР в митохондриях легко обратим.

При повреждении мембранымитохондрий,ведущемкснижениюмембранногопотенциала,протоннаяАТРсинтаза (F0F1-ATPаза) катализирует гидролиз АТР не сопряженный ссовершением полезной работы. Учитывая высокую активность этого фермента,полный гидролиз клеточной АТР мог бы занять лишь несколько минут и привести кнеобратимым последствиям. Наши исследования показали, что на разныхуровняхорганизацииклеткисуществуютзащитныемеханизмы,предотвращающие гидролиз АТР и последствия падения уровня АТР в клетке.В митохондриях сосредоточено дыхание клетки, которое неизбежносопряженокислорода)си«утечкой»электроновобразованием(одноэлектроннымсупероксид-радикала.восстановлениемСупероксидбыстродисмутирует с образованием пероксида водорода (наиболее долгоживущегопредставителя АФК), который может дать начало более активным АФК (преждевсего гидроксил-радикалу) в реакции Фентона. Кроме того, супероксид, реагируя сNO, вызывает образование активного радикала пероксинитрила.

Все АФК,образуемые в митохондриях, чрезвычайно опасны для клетки и в норме ихпродукция уравновешена различными антиоксидантными системами, которые3находятся как в митохондриях, так и в цитоплазме. Повреждение митохондрийчревато избыточной продукцией АФК, с которой антиоксидантные системы несправляются. Наши исследования были направлены на изучение защитныхмеханизмов способных защитить клетку в этих условиях.Выраженная дисфункция митохондрий может оказаться несовместимой снормальным функционированием клетки. Поврежденная клетка представляетопасность, как для окружающей ткани, так и для организма в целом.

Основныммеханизмомзащитывэтомслучаеявляетсяапоптоз,позволяющийэлиминировать клетку с минимальным ущербом для ее окружения. Наширезультаты свидетельствуют о том, что митохондрии не только участвуют вреализации программы апоптоза, но и служат важнейшим сенсором, способныминициировать апоптоз.Актуальность исследований в этой областиопределяется тем, чтоповреждением митохондрий и связанный с этим окислительный стресс лежит воснове многих тяжелых патологий, в частности инфарктов, инсультов инейродегенеративных заболеваний.

Изучение механизмов защиты клетки отдисфункции митохондрий позволит более эффективно бороться с этимизаболеваниями.Этиисследованиядолжнысодействоватьразработкепринципиально новых эффективных лекарственных средств, мишенью длякоторых являются митохондрии.Цель и задачи исследования.Целью данной работы было исследование механизмов защиты клетки отдисфункции митохондрий, которая связана с непродуктивным гидролизом АТР иокислительнымповреждением,атакжеразработкаииспытаниеновыхпрепаратов, действие которых направлено на митохондрии.Задачи исследования:1) Изучениемолекулярныхмеханизмов,блокирующихгидролиз АТР при повреждении митохондрий;2) Изучение роли митохондрий в развитии окислительногостресса;3) Изучениезащитнойпрограммы,направленнойэлиминацию поврежденных митохондрий (митоптоза);4на4) Исследованиеапоптоза,вызванногодисфункциеймитохондрий, как защитной программы;5) Разработкаииспытанияновыхмитохондриально-направленных антиоксидантов.Научная новизна работы.В работе исследованы защитные системы, позволяющие уменьшитьразрушительныесистематическоепоследствияизучениедисфункцииэтихсистеммитохондрий.намолекулярномПроведеноуровне,наизолированных митохондриях и на клетках в культуре.Показано,чтовмитохондрияхсуществуютмеханизмы,которыеэффективно тормозят непродуктивный гидролиз АТР.

Даже временное инеполное снижение уровня АТР индуцирует апоптотическую гибель клеток,защищая от повреждения окружающую ткань.Показано, что при окислительном стрессе митохондрии служат основнымисточником активных форм кислорода (АФК). Наряду с антиоксидантнымисистемами клетка использует для защиты от стресса программу элиминацииповрежденныхмитохондрий(митоптоз),котораявключаетоткрытиенеселективных пор во внутренней мембране митохондрий, их фрагментацию имеханизм элиминации, сходный с экзоцитозом.Показано, что накопление АФК в митохондриях может инициироватьапоптоз и вести в выработке сигнала, вызывающего апоптоз окружающих клеток.При патологических процессах эта защитная программа может усиливатьповреждение тканей и органов.

Установлено, что новые митохондриальнонаправленные антиоксиданты эффективно блокируют накопление АФК, апоптоз ивыработку межклеточного сигнала апоптоза при окислительном стрессе.Научно-практическое значение работы.Проведенныеисследованияоткрываютновыефундаментальныеклеточные механизмы, лежащие в основе патологий, связанных с дисфункциеймитохондрий и с развитием окислительного стресса. Понимание этих механизмовуказывает новые пути для разработки терапевтических подходов и лекарственныхсредств.Проведенныеиспытанияновых5митохондриально-направленныхантиоксидантов показали перспективность их применения при инфарктах,инсультах и нейродегенеративных заболеваниях.Основные положения, выносимые на защиту1. При повреждении мембраны митохондрий активируются механизмы регуляциимитохондриальнойАТРсинтазы,способныеэффективнотормозитьнепродуктивный гидролиз АТР.2.

Временное и неполное снижение уровня АТР индуцирует апоптотическуюгибель клеток.3. При окислительном стрессе митохондрии служат основным источникомактивных форм кислорода (АФК).4. Для защиты от окислительного стресса клетка может использовать программуэлиминации поврежденных митохондрий (митоптоз), которая включает открытиенеселективных пор во внутренней мембране митохондрий, их фрагментацию имеханизм элиминации, сходный с экзоцитозом.5. Накопление АФК в митохондриях может инициировать апоптоз и вести ввыработкесигнала,вызывающегомитохондриально-направленныеапоптозокружающихклеток.антиоксидантыэффективноработыпредставленыНовыеблокируютэтипроцессы.Апробация работы.РезультатыдиссертационнойбылинаШколах-конференциях по биоэнергетике (1976-1990гг), международной конференции«Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1980-2007гг), европейскихбиоэнергетических конференциях EBEC (Валенсия, 1994, Лювен, 1996, Брайтон,2000, Пиза 2004,Москва, 2006, Дублин, 2008), европейских конференциях поапоптозу ECDO (2005, 2006, 2007, 2008), конгрессах FEBS 1984, 2004 и IUBMB2006.Публикации.

Основные положения диссертации опубликованы в 62 печатныхработах (включая 6 обзоров) в журналах, рекомендованных ВАК.6РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1. Нарушение биоэнергетических функций митохондрий в клеткеПричиной дисфункции митохондрий в клетке могут служить как внешниевоздействия, так и процессы, протекающие внутри клетки. Классическимпримером служит терморегуляторное разобщение открытое В. П. Скулачевым в1960г. Возникающая при участии разобщающих белков и жирных кислотпротонная проводимость внутренней мембраны митохондрий ведет к свободномуокислениюсубстратов,энергиякоторогорассеиваетсяввидетепла.Кратковременное нарушение окислительного фосфорилирования характерно длявозбудимых клеток, таких как нейроны.

В таких клетках снижение мембранногопотенциала(деполяризация)митохондрийпроисходитвобластях,гдепроведение сигналов связано с резким повышением концентрации Ca2+ вцитоплазме.Мы исследовали состояние митохондрий в фибробластах человека и вклетках карциномы HeLa, используя специфические потенциал-чувствительныефлуоресцентные зонды (Митотрекер красный, TMRM и др.). Одновременномитохондрии окрашивали Митотрекером зеленым, который накапливается вмитохондрияхмитохондриях,независимоотмембранногопотенциала.НакапливаясьвTMRM тушит флуоресценцию Митотрекера зеленого, а вдеполяризованных митохондриях она остается высокой.

Этот подход позволилвыявить митохондрии с пониженным потенциалом, определить их содержание илокализацию в клетке. В фибробластах основная часть деполяризованныхмитохондрий расположена в ламеллярной области вблизи от активного края (Рис.1). Возможно, в этой области митохондрии выполняют какие-то сигнальныефункции.Вдвухисследованныхлинияхклетоккарциномысодержаниедеполяризованных митохондрий было значительно ниже, чем в фибробластах ионибыли локализованы как на периферии, так и в перинуклеарной областиклетки (Рис. 2, 3). Непосредственные причины деполяризации нам установить неудалось, но было показано, что повышенный градиент рН и усиленный синтез АТРне определяют снижение потенциала.

Можно полагать, что снижение потенциаласвязано с повышенной ионной проводимостью внутренней мембраны этойфракции митохондрий. Падение мембранного потенциала приводит к ускорениюдыхания митохондрий и повышению продукции АФК.7АБВРис.1. Выявление в клетке митохондрий с пониженным мембранным потенциалом.Фибробласты инкубировали с 200 нМ Митотрекера зеленого и 400 нМ TMRM в течение 15мин и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Накопленный TMRMвызывал тушение флуоресценции Митотрекера зеленого лишь в митохондриях с высокиммембранным потенциалом. Яркое зеленое окрашивание свидетельствовало о сниженномпотенциале (А). Б - распределение отношения зеленой (Митотрекер) и красной (TMRM) ифлуоресценции в митохондриях.