Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий, страница 3

Гибель клеток HeLa, вызванная временным падением уровня АТР в клетках.Клетки инкубировали 3 ч в среде содержавшей 2-ДОГ и(или) митохондриальныеингибиторы (как на Рис. 4) и 48 ч в среде с высоким содержанием глюкозы. Клеткиокрашивали Hoechst 33342 и йодистым пропидием и анализировали с помощьюфлуоресцентной микроскопии.Основнымсопровождаласьмеханизмомхарактернойгибелиявлялсяфрагментациейапоптоз.ДНКГибельиклетокпоявлениемфосфатидилсерина на поверхности (Рис. 6 А). Оверэкспрессия антиапоптозногобелка Bcl-2 или добавка ингибитора каспаз zVADfmk блокировали апоптоз, непредотвращая падение уровня АТР.

Интересно, что zVADfmk одновременноусиливал проявление некроза (Рис. 6 Б), что указывает на защитную роль каспазв этих условиях. Увеличение времени инкубации клеток в присутствии 2-ДОГ имитохондриальных ингибиторов с 3 ч до 5 ч приводило преимущественно кнекротической гибели через 48 ч после восстановления уровня АТФ (Рис. 6В).14АБВРис. 6. Временное снижение АТР может вызывать какапоптоз, так и некроз вклетках HeLa.Условия инкубации как на Рис. 4. Гибель клеток анализировали через 48 ч послевосстановления уровня АТР в клетках. А - электрофорез ДНК. Дорожки: 1-ДОГ + FCCP, 2ДОГ + миксотиазол, 3-ДОГ + олигомицин, 4-Контроль, М – маркеры.

Б, В - гибель клетоканализировали как на Рис. 5. Bcl-2 – линия клеток HeLa, экспрессирующая белок Bcl-2.Апоптоз, вызванный кратковременным снижением АТР имел те жехарактерные черты, что и апоптоз вызванный другими стрессовыми факторами(см. ниже). В частности, мы наблюдали транслокацию белка ВАХ из цитоплазмы вмитохондрии и выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму.

Выходцитохрома,нонетранслокацияВАХбылиблокированывклеткахэкспрессирующих Bcl-2. Ингибитор каспаз zVADfmk не влиял ни на транслокациюВАХ, ни на выход в цитоплазму цитохрома с, так что активация каспаз, повидимому, происходила по цитохром с-зависимому механизму. Вопрос омеханизме индукции апоптоза в этой модели остается открытым. Интересно, что,несмотря на участие митохондрий в апоптозе, нарушение их биоэнергетическихфункций не препятствует осуществлению программы. К такому же выводу мыпришли,исследовавапоптоз,вызванныйингибиторомпротеинкиназстауроспорином, фактором некроза опухолей и окислительным стрессом (см.ниже).

Устойчивость апоптоза к нарушениям функций митохондрий указывает на15возможностьиспользованияэтойпрограммывусловияхповреждениямитохондрий различной природы.Обнаруженный нами запуск апоптоза при кратковременном снижении АТРна 60-70%, когда остаточный АТР остается в миллимолярном диапазонеконцентраций, позволяет предположить существование в клетке специальнойсистемы детекции энергетического состояния.

Возможными кандидатами на рольсенсоров являются киназы mTOR и АМРК. Первая имеет аномально высокую Kmпо АТР, а вторая аллостерически активируется АМР. Обе киназы участвуют врегуляции метаболизма и экспрессии генов при различных видах голодания.Конечно, нельзя исключить, что наряду с ATP, ADP и АМР могут детектироватьсяи другие метаболиты, концентрация которых резко изменяется при небольшомснижении уровня АТР.4. Митохондрии, как источник АФК при окислительном стрессеОсновными инструментами при изучении роли митохондрий в образованииАФК нам послужили новые митохондриально-направленные антиоксиданты,разработанные при нашем участии под руководством акад. В. П. Скулачева. Этисоединения, получившие название SkQ (примеры показаны на Рис.

7),представляют открытые В.П. Скулачевым и Е.А. Либерманом проникающиекатионыконъюгированныесмолекулойпластохинона,котораяявляетсяэффективной ловушкой кислородных радикалов. Эти антиоксиданты эффективнонакапливаютсявмитохондриях,нейтрализуютАФКирегенерируются(восстанавливаются) дыхательной цепью, что позволяет использовать их в крайненизких наномолярных концентрациях.Рис. 7. Формулы основных митохондриально-направленных антиоксидантов (SkQ),использованных в работе.Митохондрии являются единственным компартментом клетки, имеющимотрицательный (относительно цитоплазмы) заряд, так что можно было ожидатьселективного накопления SkQ в этих органеллах клетки. Накопление SkQ вклетках было исследовано с помощью флуоресцентного производного SkQR1,16несущеговкачествекатионаостатокродамина19.Экспериментысфибробластами человека показали, что SkQR1 избирательно накапливается вмитохондрияхмитохондрийклетокс(Рис.помощьюнакопление SkQR1.8).РассеиваниепротонофорногомембранногоразобщителяпотенциалапредотвращаетНакопление SkQR1 достигает максимума за 1,5–2 ч и вдальнейшем не растет.

После отмывки лишь часть SkQR1 выходила из клеток(рис. 8).АБРис. 8. Накопление SkQR1 в фибробластахчеловека.А - клетки инкубировали 2 ч с SkQR1 (50 нМ) иселективныммитохондриальнымкрасителемМитотрекером зеленым (5 мкМ). Конфокальнаямикроскопия. Б - кинетика накопления SkQR1(50нМ). Через 3ч SkQR1 отмывали и наблюдали еговыход из клеток.

FCCP (10 мкМ) был добавленодновременно с SkQR1 или при отмывке. Данныепроточной цитометрии.Аналогичные эксперименты, проведенные на клетках HeLa и других линий,подтвердили митохондриальную локализацию SkQ. Накопление SkQR1 былозаметно снижено во многих опухолевых клетках и дальнейший анализ показал,чтопричинойтому являетсявысокая активностьсистеммножественнойлекарственной устойчивости в этих клетках. Подавление основного компонентаэтойсистемыР-гликопротеидаспомощьюспецифическихингибиторовзначительно увеличивало накопление SkQR1 в опухолевых клетках.Для выяснения механизмов митохондриальной продукции АФК и их роли вгибели клеток нами были использованы две модели.

В первой, эта продукция17индуцироваласьфотодинамическойобработкой,авкачествефотосенсибилизатора использовался флуоресцентный краситель Митотрекеркрасный (хлорометил-Х-розамин), селективно накапливающийся в митохондриях.Во второй модели продукцию АФК индуцировали добавкой пероксида водорода. Вобоих случаях после периода индукции наблюдалась продолжительная генерацияАФК, которую измеряли с помощью флуоресцентного индикатора CM-DCFН-DAчувствительного, преимущественно, к перекисным радикалам.

При освещенииклеток содержащих Митотрекер первоначально наблюдалось накопление АФК вмитохондриях, а затем они распространялись по всей клетке (Рис. 9).АБВГРис 9. Продукция АФК в клетках HeLa, вызванная фотоактивацией Митотрекеракрасного.Показана зеленая флуоресценция CM-DCF и ее совмещение с красной флуоресценциейМитотрекера: А – до засветки, Б – сразу после фотоактивации, В - через 10 минут послефотоактивации. Г - накопление АФК через 20 мин после фотоактивации. Добавкиротенона (2 мкМ), пиерицидина А (2 мкМ), миксотиазола (2 мкМ), DPI (10мкМ) и NAC (20мМ) сделаны за 1 ч до засветки, SkQ1 (20нМ) добавлен за 7 сут.

Данные флуоресцентноймикроскопии.Флуоресценция CM-DCF линейно возрастала в течение 20-30 мин послезасветки, что указывало на активную продукцию АФК в клетке. Митохондриальнонаправленный антиоксидант SkQ1 в чрезвычайно низкой концентрации (20 нМ)подавлял продукцию АФК, а традиционный антиоксидант N-ацетилцистеин (NAC)былэффективенлишьприконцентрации20мМ,чтоуказывалонамитохондриальное происхождение АФК.

Ингибиторы комплекса I дыхательнойцепи митохондрий ротенон и пиерицидин А, а также ингибитор комплекса III18дыхательной цепи миксотиазол значительно стимулировали продукцию АФК, в товремя как ингибитор флавиновых ферментов дифенилен иодониум (DPI) ееблокировал (Рис. 9Г). Эти данные позволили предположить, что продукция АФК внашей модели осуществлялась при участии флавинового компонента комплекса Iв процессе прямого переноса электронов по дыхательной цепи. Подобныйэффект фотоиндуцированной продукции митохондриальных АФК наблюдалсяранее в мышечных клетках (Д. Б. Зоров и сотр.).В качестве индуктора продукции АФК в фибробластах был использованпероксид водорода.

Было показано, что добавленный к клеткам Н2О2 разлагаетсяв течение 15-20 минут, вероятно, вследствие высокой активности каталазы идругих антиоксидантных ферментов в среде роста. Накопление АФК в клетках,измеренное с помощью CM-DCF-DA наблюдалось в течение 2 ч, а затемснижалось до исходного уровня. Накопление АФК значительно стимулировалосьингибиторами дыхания пиерицидином и миксотиазолом и предотвращалось DPI имитохондриально-направленнымантиоксидантомSkQ1,чтоуказываетнаактивацию продукции АФК в митохондриях под действием пероксида водорода(Рис.

10).А60БконтрольSkQ1, 1 сутки50флуоресценция CM-DCF, у.е.SkQ1, 7 суток403020Рис. 10. Накопление АФК в фибробластахвызванное Н2О2. (0,3 мМ).Клетки окрашивали CM-DCF-DA через 2 ч(А) или через указанные промежуткивременипоследобавкиН2О2(Б).Пиерицидин (пиер., 2 мкМ) добавляли за1ч, а SkQ1 (20 нM) за 1 сут или за 7 сут доН2О2.1000ч1ч2ч3ч4чВремя после добавки H2O2Результаты проведенных исследований показали, что при различных видахокислительного повреждения клетки: локальном (фотодинамическое воздействие19на митохондрии) или генерализованном (обработка пероксидом водорода)митохондрии могут служить основным источником эндогенной продукции АФК.Возможно, избыточное образование АФК в митохондриях лежит в основе целогоряда патологий связанных с окислительным стрессом.